HPLC法测定复方首乌地黄丸中二苯乙烯苷的含量

乐正永　聂明华　曾芳俐　李　敏（遵义市食品药品检验所　遵义563000）



HPLC法测定复方首乌地黄丸中二苯乙烯苷的含量

乐正永聂明华曾芳俐李敏（遵义市食品药品检验所遵义563000）

摘要：目的：建立高效液相色谱法测定复方首乌地黄丸中制何首乌的2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-0-/3-D-葡萄糖苷（简称二苯乙烯苷）的含量。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱为WIech UItimateRXB－C1（8250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-水（18∶82），检测波长为320nm，流速为1.0mL·min－1。结果：二苯乙烯苷在0.052～1.05μg范围内线性关系良好（R=0.9999）。平均回收率为99.42%（RSD=0.52%n=6）。结论：此方法简单，快速，重现性好，可作为复方首乌地黄丸的质量控制方法。

关键词：复方首乌地黄丸制何首乌二苯乙烯苷

复方首乌地黄丸处方由制何首乌、地黄、女贞子（酒制）、墨旱莲等药材加工制成，具有滋阴补肾、乌须黑发、壮筋骨的功效，用于腰膝酸软、头痛眩晕、须发早白。该药品收载于部颁标准《中药成方制剂》第五册，质量标准仅有理化鉴别和通则检查，专属性不强。该药品中制何首乌为君药，二苯乙烯苷是君药的主要成分之一，故采用高效液相色谱法测定二苯乙烯苷的含量，为鉴别该药品提供科学的依据。

1　仪器与试药

LC-20AD型高效液相色谱仪、二元泵、二极管阵列检测器（日本岛津公司），色谱柱：WIech UItimateRXB－C18（250mm× 4.6mm，5μm）；KQ-300DE型数控超声波清洗器，工作频率40Hz，超声电功率300W（昆山市超声仪器有限公司）；AB265-S电子十万分之一分析天平（梅特勒-托利多公司）；2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-0-/3-D-葡萄糖苷对照品（批号：110844-201310，中国食品药品检定研究院）；复方首乌地黄丸（批号：120901、130101、130601，通药制药集团股份有限公司）。

2　方法与结果

2.1二苯乙烯苷含量测定

2.1.1检测波长的选择：精密称取二苯乙烯苷适量，加稀乙醇溶解，制成每1mL含0.013mg/mL的二苯乙烯苷溶液，用紫外-分光光度计，在200～800nm波长范围内进行扫描，结果在320nm波长处有最大吸收，故选320nm为检测波长。

2.1.2色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：WIech UItimateRXB－C1（8250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（18∶82）；柱温：25℃；流速：1mL/min；检测波长：320nm。理论板数按二苯乙烯苷峰计算可达7000，在此条件下，二苯乙烯苷与其他成分达到基线分离。

2.1.3对照品溶液的制备：取二苯乙烯苷5.23mg，置10mL量瓶中，加稀乙醇制成0.523mg/mL，摇匀，作为储备液；取储备液1.0mL置10mL量瓶中，加稀乙醇制成0.0523mg/mL，摇匀，备用。

2.1.4供试品溶液的制备：取样品的粉末约1g，置25mL量瓶中，加稀乙醇近刻度，超声15min，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，以0.45μm有机滤膜滤过，取续滤液即得。

2.1.5阴性对照溶液的制备：按制剂工艺制备缺酒制何首乌的样品，同法（2.1.4）制得阴性对照液。

2.1.6专属性试验：吸取对照品溶液、供试品溶液以及阴性对照溶液各10μL，分别注入色谱仪，同法测定，结果在二苯乙烯苷峰的相应位置及保留时间上，阴性对照无干扰，见下图。

2.1.7线性关系考察：取对照品溶液，分别进样1、2、5、10、15、20μL，记录色谱图，以二苯乙烯苷进样量（μg）为横坐标，以峰面积平均值为纵坐标，计算得回归方程为：y=3.5×106x-43110（n= 6），R=0.9999，结果表明二苯乙烯苷在0.052～1.05μg范围内，线性关系良好。

2.1.8精密度试验：精密吸取供试品溶液进样10μL，重复进样6次，二苯乙烯苷峰面积相对标准偏差（RSD）为0.74%，表明进样方法和仪器精密度良好。

2.1.9重复性试验：精密称取样品粉末6份，按“2.1.3”项下条件制备样品溶液，精密吸取10μL，进样分析，二苯乙烯苷峰面积的RSD为0.94%（n=6），方法重现性良好。

2.1.10稳定性试验考察：精密吸取供试品溶液10μL，按色谱条件，分别在3、6、9、12、15、24、48h进样测定，结果表明二苯乙烯苷在48h内稳定，相对标准偏差（RSD）为0.53%。

2.1.11加样回收率试验：精密称取已知二苯乙烯苷含量的复方首乌地黄丸样品，分别加入二苯乙烯苷对照品溶液适量按供试品溶液制备并测定，计算回收率，二苯乙烯苷的平均加样回收率为99.42%（RSD=0.52%）。

表1　加样回收率试验结果（n=6）

2.1.12样品含量测定：分别取不同批号的样品，按本法的测定条件，分别测定各样品中二苯乙烯苷的含量，结果见表2。

表2　样品含量测定结果（n=3）

3　讨论

3.1本文采用高效液相色谱法测定何首乌中二苯乙烯苷的含量，该法专属性强，灵敏，简便快速，重现性好，准确可靠。

3.2流动相的考察，本次实验对多种比例：40∶60、30∶70、20∶80、18∶82等的乙腈—水进行比较，结果表明以乙腈—水（18∶82）最理想，分离效果好，理论塔板数在7000以上。

3.3在供试品溶液的制备中，选用加稀乙醇超声15min[1]，加稀乙醇加热回流30min[2]，加稀乙醇超声40min[3]，加稀乙醇加热回流30min[4]，结果：4种方法比较，RSD=0.66%。故选用加稀乙醇超声15min制备供试品溶液，省时，操作简便，提取完全。

3.4本品制何首乌为君药，具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂作用，有效成分为二苯乙烯苷，因此测定复方首乌地黄丸二苯乙烯苷的含量，对控制复方首乌地黄丸的质量，保证疗效有一定意义。

参考文献

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[4]国家药典委员会.中国药典[S].第1部，北京：化学工业出版社，2010:164.

Determ ining content of 2，3，5，4'-Stibene Glycoside in Shouwu Dihuang Compound Pill by HPLC

Le Zhengyong Nie Minghua Zeng Fangli LiMin（Zunyi Institute for Food and Drug Control，Zunyi563000）

Abstract：Objective：To establish method for determining the content of 2，3，5，4'-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glycoside（simply named as 2，3，5，4'-stilbene glycoside）from Radix Polygoni Multiflori Prepareparata in Shouwu Dihuang Compound Pill by HPLC. Methods：Itwas performed by HPLCwith WIech UItimateRXB－C18（250mm×4.6mm，5μm）.Themobile phasae consisted of acetonitrile and wate（r 18∶82）.The flow rate was 1.0mL·min-1with the detection wavelength at 320nm.Results：2，3，5，4'-stilbene glycoside showed a good linear relationship within the range of 0.052～1.05μg（R=0.9999）.The average recovery was 99.42%with RSD=0.52%，（n=6）. Conclusion：The method is simple，rapid，accurate and reliable，and it can be applied to control the quality of Shouwu Dihuang Compound Pill.

Key words:Shouwu Dihuang Compound Pill Radix PolygoniMultiflori Prepareparata 2，3，5，4'-stibene glycoside

中图分类号：R284.1

文献标识码：A

文章编号：1672-8351（2016）01-0005-02