“活的非可培养态”食源致病细菌的研究进展

谷立慧，钟青萍，方祥，廖振林，王丽

(华南农业大学 食品学院，广东 广州，510642)



“活的非可培养态”食源致病细菌的研究进展

谷立慧，钟青萍，方祥，廖振林，王丽*

(华南农业大学 食品学院，广东 广州，510642)

摘要食源致病细菌是影响食品质量与安全的重要生物污染源。食品加工过程中的低温、寡营养及食品防腐等条件可诱使食源致病细菌进入活的非可培养状态(viable but non-culturable state, VBNC)，处于此状态的细菌最大的特点就是丧失了平板上的生长繁殖能力，但生命体征是活的，并且保留原菌的毒力和致病性。研究表明，活的非可培养态细菌在细胞形态、基因表达、蛋白表达等方面发生了复杂变化，并且一定条件下可复苏为可培养状态，成为逃避检测的“隐性传染源”，对食品安全构成潜在威胁。文中对食源性致病菌VBNC态的诱导条件及复苏情况、生物学特性变化、现代检测技术的发展等方面的研究进行了综述。期望为解决当下由活的非可培养态细菌引起的食品安全问题提供理论参考。

关键词食源致病细菌；活的非可培养态；食品安全；生物学特性

据WHO(World Health Organization)统计，每年全球大约有15亿腹泻病人，其中因食用微生物污染的食品引起的约占70%[1]。美国CDC(Centers for Disease Control)估计，美国每年由食源性致病菌引起的疾病约有7 600万例，导致死亡的病例不在少数[2]。在食品加工过程中，如何杀灭食品中的致病菌、控制其数量以及防止其污染，一直都是食品生产者十分关心的问题。如何采取简便易行的有效方法检测食品中的致病菌种类和数量，也一直是食品质量监管部门努力的方向。然而，食源性致病菌活的非可培养状态的存在给食品安全监控工作带来了新的挑战。VBNC细菌是细菌在不良环境下的一种存活状态，用常规的培养法不能检出，在实际检测中容易造成漏检。尤其是进入活的非可培养状态的致病菌，这些致病菌在适宜的条件下又可以恢复到正常状态，对食品安全、人类健康带来了潜在的威胁。自1982年VBNC态细菌被发现起，科研工作者对VBNC态细菌的研究，尤其是VBNC态致病菌的研究不断深入，取得了一定的进展。本文从食源性致病菌VBNC态诱导条件、生物学特性变化、检测技术的发展以及复苏情况等方面对VBNC食源细菌的研究现状进行综述，以期对解决与VBNC细菌相关的食品安全、食品卫生等问题提供理论参考。

1食源性致病菌VBNC态的诱导

VBNC态是细菌应对环境压力的一种反应机制，因此许多不利于致病菌生长繁殖的条件都可能诱导致病菌进入VBNC态。在食品加工和贮藏过程中，如向食品中添加茶多酚、山梨酸钾等防腐剂或将食品低温贮藏等，均有可能诱导致病菌进入VBNC态。

低温是最重要的诱导因素，同时寡营养作为协同因素。Masmoudi研究发现，4 ℃和寡营养条件下金黄色葡萄球菌快速进入VBNC态，而20 ℃和寡营养条件下细菌仅进入一种饥饿状态[3]；郭川也用寡营养协同4 ℃低温诱导出VBNC态副溶血性弧菌[4]。黄韵等人的研究也证明，单增李斯特菌在2 ℃和pH 6.0下比在25 ℃和pH 6.0下更早进入了VBNC状态[5]。

此外，Alan等人的实验表明，光照也有利于幽门螺杆菌进入VBNC状态[6]。添加金属离子、有机物等是诱导致病菌进入VBNC态的另一重要因素。Monica等人通过添加一定浓度的铜离子诱导出VBNC态梨火疫病菌[7]。陈颖翘等人通过添加防腐剂山梨酸钾诱导出VBNC态金黄色葡萄球菌[8]。

另外，能诱导致病菌进入VBNC态的方法还有很多，如通过控制氧浓度、与真核微生物共培养等；值得一提的是，同种细菌的不同菌株的诱导条件不全相同。由于加工过程和贮藏过程中许多条件都可能无意中促使食品中的致病菌进入VBNC态，因此，人们应关注VBNC态致病菌的生长代谢情况、致病性以及VBNC态细菌检测技术的发展。

2VBNC态致病菌生物学特性的变化

活的非可培养态食源细菌在生物学特性上发生了很大的变化，尤其在细胞形态、基因表达和蛋白质表达方面，这是食源细菌为了适应外在食品加工环境而做的自我生理调整的结果。

2.1细胞外在形体变化

VBNC态致病菌形态发生改变，这可能与致病菌应对环境压力做出的形态调整相关。许多研究表明，致病菌进入VBNC态后，细胞结构没有改变，但细菌形态发生了变化，多数体积缩小成球形或不规则球形；细胞间质变大[9]；时间越长，形态发生改变的细胞比例越多[10-11]；菌形态受不同环境因素(如NaCl浓度、抗生素存在与否等)的影响不同[12]。许多VBNC态致病菌菌体较正常态的密集[13-14]，且细胞间密度增大，但也有的菌体较分散[8]。另外，VBNC态致病菌抗机械阻力增强[15]。

2.2细胞壁和细胞质的变化

有研究发现[16-17]，VBNC态细菌细胞壁变得松散、有弹性、有褶皱和凸起，细胞壁增厚，耐受性改变，如提高了对热、过氧化氢和低浓度盐的耐受性，但对胆汁盐变得敏感。FALCIONI[18]等人也发现，VBNC态副溶血性弧菌与特异性抗体的结合能力下降，说明细胞表面抗原的成分和数量可能发生改变。TREVORS[19]等人检测到VBNC霍乱弧菌细胞质密度增加，总的细胞脂质、碳水化合物、聚-β-羟丁酸(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)的量减少，可能是饥饿状态下细菌在利用这些物质供能。

2.3核酸和蛋白质的变化

目前人们对食源性致病菌VBNC态的研究已经深入到分子水平，VBNC态致病菌蛋白质合成和基因的表达是人们研究的一个重点。

VBNC态致病菌的蛋白质含量和种类都有所变化。LAI[20]检测到VBNC副溶血性弧菌中13种蛋白质含量增加，其中有与转录、翻译、ATP合成、糖异生作用等相关的酶，还有一些未知功能的酶类。Pawlowski[9]的研究也发现VBNC鼠疫杆菌能吸收和整合放射性的氨基酸。这都表明，VBNC态细菌的生命活动还在持续进行。

但从总体来看，VBNC态致病菌代谢强度是减弱的，且维持在VBNC态时间过长，细菌会逐渐走向死亡。ZHAO[15]检测到VBNC态大肠杆菌的总体酶活力比可培养态的弱；潘乐[21]发现提取的VBNC态沙门氏菌和大肠杆菌mRNA浓度均小于可培养态；TREVORS[19]检测到霍乱弧菌DNA、RNA和蛋白质的含量也在下降，当DNA含量下降到一个阈值时，VBNC态将不可复苏，逐渐走向死亡。

值得注意的是，致病菌VBNC态仍然保留其致病基因，且仍能表达，从而表现出致病性。刘静宇[22]检测到VBNC态副溶血性弧菌毒力基因tdh2的表达；PATRONE[11]检测到VBNC态空肠弯曲杆菌CadF蛋白的表达，证实其仍有粘附在肠道黏膜的能力。另外，研究者们也发现了食源性致病菌某些基因对其进入、维持VBNC态以及复苏到可培养态有非常重要的意义，如AhpC基因、VP2468基因、过氧化氢酶和超过氧化物歧化酶基因等[3,10,23]；还有发现VBNC态致病菌增加了某些基因[10]，这可能是细菌在进入VBNC态时，发生了变异以应对环境压力。

3VBNC态致病菌的检测方法

从目前研究来看，食源性致病菌进入VBNC态对食品的卫生与安全存在着不容忽视的威胁，因此针对VBNC态致病菌，发展有效的检测方法是目前研究中非常严峻且重要的任务。现阶段，用于VBNC态致病菌的检测方法有很多，常用的方法主要有：吖啶橙荧光显微镜直接计数法(acridine orange direct count, AODC)、活菌直接计数法(direct viable count, DVC)、平板计数法(plate count, PC)、死/活细菌检测试剂盒(LIVE/DEAD baclight bacterial viability kit )、流式细胞仪、免疫学法以及分子生物学法等。

3.1经典方法

经典方法即吖啶橙荧光显微镜直接计数法、活菌直接计数法及平板计数法三者结合法，一直沿用至今[4]。AODC法原理是吖啶橙与RNA或单螺旋DNA结合发出红色荧光，与双螺旋DNA结合发出绿色荧光，通过显微镜观察直接计数。影响荧光颜色的因素众多，如细菌状态、吖啶橙浓度、PH值等，因此AODC法用于检测总菌数。DVC法是将DNA抑制剂萘啶酮酸和酵母浸膏加到细菌培养物中，培养6h固定后用吖啶橙染色。VBNC态细菌DNA合成受到抑制而不分裂，但能吸收营养而生长，该法能检出具有代谢活性的活菌数。但多数G+菌和少数G-菌对萘啶酮酸产生抗性，因此，有研究用环丙沙星代替萘啶酮酸，取得较好的结果[14,24]。

3.2LIVE/DEAD 试剂盒

LIVE/DEAD试剂盒由两种专染核酸的染料组成，一种是能渗入具有完整细胞膜结构的绿色荧光染料SYTO-9，一种是仅能渗到细胞膜破损的菌体内且与SYTO-9竞争核酸着染位点，削弱绿色荧光的红色染料碘化丙锭PI。此法染色后，活菌呈现绿色，死菌呈现红色。该方法的优点是操作简便、省时，使用广泛，缺点是无法对其中的细菌种类进行鉴别，且各类染料存在强烈的致癌作用，并且价格较高[5]。

3.3流式细胞仪

细菌细胞群具有生理阶段的不均一性，因此细菌在特殊仪器中可产生不同动力，从而实现流式细胞仪对细胞或亚细胞结构进行快速测量，且能进行定量分析。该方法优点是能够通过流式图显示颗粒分散程度和位置，明显地对VBNC态细菌进行识别，流式细胞仪与荧光染料联合运用可客观评价细菌活性状态，在死活细菌的数量和两者数量比例关系上进行比较准确的分析[18,25]。缺点是，无法鉴定是具体哪一种类的微生物[26]，分析样品时所需荧光染料剂量比较大，成本较高。

3.4免疫技术

免疫学方法应用的原理是活的VBNC态细菌仍具有抗原性，且能与其特异性抗体结合。刘光明[27]等人使用抗血清和磁性微珠制备弯曲菌免疫磁珠，建立IMC-FPCR检测方法，该方法灵敏度高、选择性好、简便，可在24 h 内完成对VBNC态空肠弯曲菌的检测。郭川[4]等人用抗血清捕获菌体后对其tlh基因进行PCR扩增，检测到VBNC副溶血性弧菌。但是，许多VBNC态致病菌形态发生变化，如皱缩、体积缩小等，有的表面与特异性抗体结合的能力下降[18]，因此，免疫检测法的准确性受到 VBNC态致病菌本身的干扰。

3.5分子生物学方法

VBNC态致病菌的检测方法还有很多，如呼吸检测法、ATP含量检测法、放射自显影法以及GFP基因检测法等，多数是根据致病菌的代谢产物来进行检测。然而，由于VBNC态致病菌生物学特性变化多样，以上方法均有一定的局限性。目前研究最多的是分子生物学检测方法，该方法具有特异性强、检测限低、快速便捷等优点，是将来最有可能有效应用于VBNC态食源性致病菌检测的方法。

细胞内的mRNA不稳定，易被核酸酶快速降解，是活细胞的信号分子，因此利用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription and polymerase chain reaction，RT-PCR)技术直接检测mRNA是目前公认的比较适合的标准之一。RT-PCR检测技术被广泛用于VBNC的空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌等致病菌的检测[11,28]。

逆转录实时荧光定量PCR(reverse transcription and real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。具有特异性强、灵敏度高的特点，能有效解决PCR交叉污染问题。潘乐[21]建立了VBNC态的大肠杆菌和沙门氏菌的RT-qPCR检测方法，该方法敏感性、特异性和重复性均很理想。刘静宇用RT-qPCR检测VBNC副溶血性弧菌，鉴定基因toxR 的最低检测限可达到48CFU/mL[20]。

EMA/PMA-qPCR技术是基于活菌细胞膜完整性来检测VBNC细菌的。EMA(ethidium monoazide,叠氮溴乙锭)和PMA(propidium monoazide,叠氮溴化丙锭)是DNA染料，能穿透死细胞的细胞膜并与其DNA共价交联形成沉淀，在提取细菌DNA时死菌能被除去，阻止死细胞DNA扩增。田聪、Dinu用PMA-qPCR检测VBNC态大肠杆菌，检测限分别可达到100 CFU/mL和1 000 CFU/mL[14,29]；黄韵等[5]用PMA-qPCR检测蔬菜样品中的VBNC单增李斯特菌，检测限为1 000 CFU/g蔬菜叶子。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification , LAMP)不需要模板的热变性、温度循环及荧光显微镜观察等过程，因此不需要昂贵的实时荧光PCR仪，且具有简单、快速、特异性强、高灵敏度等特点。WANG[30-31]等人用EMP-LAMP技术检测VBNC态副溶血性弧菌，且对比发现，EMA-LAMP检测技术的检测灵敏度远高于EMA-PCR检测技术。

4VBNC态致病菌的复苏

VBNC态致病菌虽仍能表达致病基因，但更令人担心的是其复苏到可培养态后，在食品中生长繁殖，从而使食品败坏或使人致病。目前许多研究发现，通过升温的方法可以有效地使VBNC态致病菌复苏[3,32]。因此推测，若在食品低温贮藏期内进入VBNC态的致病菌，在常温解冻、销售、储运过程中有可能复苏为可培养态。

目前研究结果表明，通过添加促使复苏的化学物质以及与真核细胞共培养可使VBNC致病菌复苏。曹小红等通过添加吐温20、过氧化氢酶等使VBNC态大肠杆菌和金黄色葡萄球菌复苏[16]；Yuta等通过添加丙酮酸盐、α-酮丁酸等使VBNC态沙门氏菌复苏[33]。另外，添加的有机物可以激活细胞，促使DNA的表达和蛋白质的合成，从而促进复苏。Mitsutoshi将VBNC态霍乱弧菌与多种真核细胞共培养使其复苏，且在真核细胞提取物中发现并命名了PCVC复苏因子[34]，并提出，PCVC复苏因子和Rpf将是研究VBNC态细菌复苏的一个重要方向。

由于不同的食源性致病菌对生长环境条件的要求不同，因此不同致病菌的复苏条件不同。值得关注的是，并非所有VBNC态致病菌都能复苏。当致病菌处于VBNC态时间过长，或丢失了某些基因，如过氧化氢酶基因缺陷，则VBNC态致病菌不可复苏，这为消除VBNC态致病菌提供了方向。

5展望

当今食品安全问题是国人关注的热点问题，而VBNC态食源致病菌的存在无疑是对食品安全和人们健康有着不可估量的潜在威胁。到目前为止，报道的VBNC态细菌的种类已经多达70多种，其中VBNC态的金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、单增李斯特菌等常见致病菌比较多见，人们对其存活机理及检测技术的研究也已经深入到基因分子水平。

食源性VBNC态致病菌的存在，向食品企业和食品质量监管部门提出了新的挑战。如何优化工艺条件以防止食源性致病菌在食品加工过程中进入VBNC态，以及如何杀灭VBNC态致病菌或阻止其复苏，将是食品生产企业急需解决的问题，另外，如何改进目前的分子生物学检测技术，使其更快速、便捷、有效和低成本，将是食品企业和食品质量监管部门共同面临的问题，也是目前研究的方向。

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Research progress on the viable but non-culturable state of food-borne pathogenic bacteria

GU Li-hui, ZHONG Qing-ping, FANG Xiang, LIAO Zhen-lin, WANG Li

(College of Food Science,South China Agricultural University，Guangzhou 510642,China)

ABSTRACTThe food-borne pathogenic bacteria are the important source of biological pollution, which influence the food quality and safety. Low temperature, poor nutrition and food preservation can induce the food-borne pathogenic bacteria into VBNC. At this state, these bacteria characterized in that they are no longer able to grow and form colonies on culture media , but their vital signs are still alive and their virulence is maintained. Studies showed that the bacteria at VBNC state were complicated changed in morphology, gene and protein expression and could regain to be culturable. It might become latent infection escaping detection to threaten food safety. Researches on inducing condition and resuscitation, biological characteristic change and the development of detection technology of food-borne pathogenic are summarized in this paper, which may provide theory basis for the study on food safety problem caused by the VBNC state of bacteria.

Key wordsfood-borne pathogenic; VBNC; food safety; biological characteristic

收稿日期：2015-06-18，改回日期：2015-08-07

基金项目：国家自然科学基金：食品防腐环境下食源细菌应激进入活的非可培养状态的机制研究(31000781);基于PPAR通路的A型原花青素肠道菌群代谢物抗动脉粥样硬化用与机制研究(31471705);基于组学的副溶血弧菌"活的非可培养状态"的分子机理研究(31271956);国产高纯度天然右旋龙脑规模化生产关键技术研究(2012B091100075)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602046

第一作者：硕士研究生(王丽为通讯作者，E-mail:wangli_scau@sacu.edu.cn)。