蛇床子素脂质体凝胶剂的制备及其体外透皮试验的初步研究

赖滢滢，周若鹏，张英丰，王岩

(1.广东药学院 中药学院，广东 广州 510006； 2.广州奇绩医药科技有限公司，广东 广州 510663；3.广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006)



蛇床子素脂质体凝胶剂的制备及其体外透皮试验的初步研究

赖滢滢1，周若鹏2，张英丰3，王岩1

(1.广东药学院 中药学院，广东 广州 510006； 2.广州奇绩医药科技有限公司，广东 广州 510663；3.广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006)

摘要:目的 制备蛇床子素脂质体凝胶剂，并对其体外渗透量及皮肤贮库效应进行考察。方法 采用薄膜分散法制备蛇床子素脂质体，再以卡波姆-940为基质制备脂质体凝胶剂；采用Franz扩散池法进行体外透皮试验，以高效液相色谱法测定蛇床子素的累积渗透量，通过药物的透皮给药吸收来评价蛇床子素脂质体凝胶剂的性能。结果 蛇床子素脂质体凝胶剂的渗透行为符合Higuchi方程，其中24 h的皮肤累积渗透量达到172.95 μg/cm2，贮库后的皮肤累积渗透量达到210.19 μg/cm2。结论 蛇床子素脂质体凝胶剂可透过皮肤被吸收，具有长效缓释作用，为研制蛇床子素的新型透皮制剂奠定了基础。

关键词:蛇床子素； 脂质体凝胶剂； 体外透皮吸收试验

自20世纪80年代以来，脂质体因能很好地模拟生物膜脂质双层结构，并具有生物膜的流动性，一直被作为生物膜模型而受到广泛重视并应用于经皮给药系统中[1]。脂质体在表皮和真皮内可形成药物贮库，使最大量的包封物保留在皮肤中，发挥长效缓释作用。凝胶剂是将药物与适宜基质制成的具凝胶特性的经皮给药半固体或稠厚液体制剂，质地均匀细腻，展开后易于涂布在皮肤上形成透明的薄膜，滞留时间长，无气闷油腻感，对皮肤和黏膜无刺激性[2]，为皮肤局部外用的常用制剂。近几年，国内外研究者对一系列的新型经皮吸收药物载体进行了研究，将脂质体分散在凝胶基质中制备成脂质体凝胶剂，形成多贮库型系统，可有效控制药物释放的速度，通过凝胶良好的黏附性降低脂质双分子的流动性，防止药物渗出脂质体，增加脂质体的稳定性，发挥长效缓释作用，从而降低药物不良反应，减少用药次数，提高生物利用度。

蛇床子及其复方制剂为治疗银屑病[3]和湿疹[4]等病的常见中草药，其有效成分为蛇床子素，但由于蛇床子素难溶于水[5]、生物利用度低[6]等性质，使得真正把蛇床子素作为一种药物应用于临床的并不多见。本文在前期完成蛇床子素脂质体制备工艺的基础上[7]，进一步制备了蛇床子素脂质体凝胶剂，并考察蛇床子素的体外透皮情况，为蛇床子素新剂型的后期研究与开发提供理论基础。

1仪器与试药

1.1仪器

LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；WFZ UV-2100型紫外-可见光光度仪(上海尤尼柯仪器有限公司)；RE-20000旋转蒸发仪(上海亚荣生化试剂厂)；TG1650-WS台式高速离心机(上海卢湘仪机电设备有限公司)；SK3300LH超声波清洗器(上海科导超声波仪器有限公司)；AUY-220型、AUW-220D型分析天平(广州仪通兴仪器仪表有限公司)；雷磁PHS-25 pH计(上海精科实业有限公司)；YK-12D透皮扩散实验仪(上海锴凯科技有限公司)。

1.2试药及原料药

蛇床子素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110822-201308，质量分数：98%)；蛇床子素原料药(南京泽朗生物科技有限公司，批号：ZL20131220JZS，质量分数：98%)；大豆卵磷脂(上海蓝季生物有限公司)；胆固醇(上海润捷化工试剂有限公司)；聚山梨酯-80(广州化学试剂厂)；Sephadex G-25葡聚糖凝胶(上海蓝季生物有限公司)；卡波姆-940(青岛天力源生物科技有限公司)；吐温80(广州化学试剂厂)；三乙醇胺(广州化学试剂厂)；Na2S(天津市大茂化学试剂厂)；生理盐水(南方医科大学珠江医院)；NaH2PO4(广州化学试剂厂)；Na2HPO4(广东省化学制剂工程技术研究开发中心)；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.3动物

昆明种雄性小鼠5只，体质量18～20 g,中山大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(粤)2012-0125。

2方法与结果

2.1蛇床子素脂质体及蛇床子素脂质体凝胶剂的制备

精密称取蛇床子素原料药10 mg、大豆卵磷脂、胆固醇、三氯甲烷适量(药物和磷脂质量比为1∶22.66，磷脂与胆固醇的质量比为4∶1，磷脂质量浓度为24.93 mg/mL)于150 mL圆底烧瓶中，超声溶解后，40 ℃减压旋转蒸发除去溶剂，然后加入含有质量分数1.67%吐温80的PBS水溶液(pH值为6.5)10 mL，50 ℃下常压旋转洗膜30 min后涡旋1 min，得到均匀无黏块的白色混悬液即为蛇床子素脂质体溶液[7]。经前期研究确定蛇床子素脂质体的优化处方并制备3批脂质体，测得包封率分别为93.12%、96.51%、95.17%，平均包封率为94.93%，RSD为1.8%。

取蛇床子素脂质体混悬液10 mL，加入卡波姆0.2 g，搅拌均匀，溶胀过夜后搅匀，用三乙醇胺调节pH为6.0～6.5后，加PBS水溶液(pH值为6.5)至20 g，搅拌均匀，放置数小时，使卡波姆940溶胀呈透明均质状态，即得到蛇床子素脂质体凝胶剂(蛇床子素质量分数约为0.05%)。同法制备空白脂质体凝胶剂。

2.2测定方法的建立

2.2.1色谱条件Hypersil ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为甲醇-水(体积比75∶25)，流速为1.0 mL/min，柱温为室温，检测波长为322 nm，进样量为10 μL，分别取蛇床子素对照品溶液、蛇床子素脂质体凝胶透皮后的样品溶液以及空白脂质体凝胶透皮后的空白溶液进样。结果表明：蛇床子素的相对保留时间为6.7 min左右，皮肤内源性成分对蛇床子素的检测无明显干扰，见图1。

2.2.2标准曲线的绘制精密称取干燥至恒质量的蛇床子素对照品10.01 mg，置10 mL量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，即得质量浓度为1.001 mg/mL的对照品溶液。取对照品溶液并用流动相稀释成质量浓度分别为5.005、15.015、30.03、50.05、60.06、75.075 μg/mL的系列对照品溶液，用0.45 μm微孔滤膜滤过,各精密吸取10 μL注入色谱仪，以峰面积对质量浓度进行线性回归，得回归方程y=4.306×104x-2.298×104,r=0.999 7。结果表明，蛇床子素质量浓度在5.005～75.075 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

BAC43210-110501050mAUmAUmAU0.02.55.07.510.0t/min

A.对照品溶液； B.样品溶液； C.空白溶液。

图1蛇床子素脂质体凝胶的高效液相色谱图

Figure 1Chromatograms of osthole liposome gel

2.2.3精密度考察和相对回收率试验取“2.2.2”项下15.015 μg/mL对照品溶液，在1天内连续进样5次，同时在连续5 d内每天进样1次，考察日内精密度和日间精密度,结果对照品溶液的日内RSD为0.63%，日间RSD为1.11%，表明仪器精密度良好。分别定量称取含蛇床子素脂质体质量分数为80%、100%、120%的凝胶各10 g，加入空白脂质体凝胶5 g，进行相对回收率试验，结果3种质量浓度溶液的平均相对回收率为101.96%,RSD为2.33%。

2.3蛇床子素脂质体凝胶剂的初步评价

2.3.1性状本品为浅黄色透明凝胶,质地均匀细腻。

2.3.2酸碱度检查分别取3批脂质体凝胶样品1 g，置于烧杯中,加入蒸馏水10 mL稀释后,搅拌5 min,测得pH值为6.0～6.5。

2.3.3离心试验分别取3批脂质体凝胶样品置于带刻度的离心管中,于5 000 r/min离心30 min,结果显示凝胶均无分层现象。

2.3.4耐热、耐寒试验分别取3批凝胶样品，置55 ℃恒温箱中8 h，于冷冻下放置24 h，取出融化后再于冷冻下放置24 h，如此重复3次，结果显示凝胶均无分层变色现象。

2.3.5皮肤刺激性试验取1只健康大白鼠，剔去背部毛，选4块完整皮肤分别涂上蛇床子素脂质体凝胶3批样品，另一块做空白对照，用医用纱布裹好，24 h后，拆开观察，结果显示均无红肿现象。

上述结果提示，以卡波姆-940为基质的优化处方制备的蛇床子素脂质体凝胶具有较好的稳定性和安全性。

2.4体外透皮试验

2.4.1离体鼠皮的制备取同一牢笼并饲养一个月后体质量为18～20 g的健康大鼠，麻醉后用剪刀除尽胸腹部毛,再用质量分数6%Na2S溶液将大鼠胸腹部脱毛，立即剥离胸腹部皮肤，剔除皮下组织和脂肪，注意操作过程中不可损坏角质层。以生理盐水漂洗干净，将上述皮肤平铺在锡箔纸上并包封完全，-20 ℃冷藏，备用。临用前置生理盐水中解冻，并确保鼠皮的完整性。

2.4.2体外透皮试验方法将制备好的新鲜鼠皮角质层向上固定在Franz扩散池上，维持温度(37±1)℃，接受室内装乙醇-生理盐水(体积比30∶70)作为接收液，并确保接受室中无气泡，皮肤固定在供给室和接受室之间，皮肤表皮层面向供给室，并且保持真皮层与溶液密切接触。扩散池的有效渗透面积(A)为3.14 cm2，接受室体积(V)为8 mL。取一定量的脂质体凝胶均匀涂布于皮肤表面，将接收池置于(37±1) ℃的恒温水浴中，开启电磁搅拌器以200 r/min的速度搅拌,于 1、2、4、6、8、12、24 h间隔取样4 mL，置于5 mL量瓶中，同时立即补充等体积同温度的接收液。以甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液注入高效液相色谱仪，测定。

离体经皮渗透试验停止后,取下皮肤,除去皮肤上残余的凝胶,用生理盐水洗净残留的样品,用滤纸吸干水分，按前述步骤进行皮肤贮库试验。

将所测得的峰面积代入回归方程，求出药物浓度，并按以下公式计算单位面积累积渗透量(Q)：

Q=(CnVn+ΣCiVi)/A，

式中：Q为单位皮肤累积渗透量，Cn为第n次取样时接收液的浓度，Ci为第i个取样点浓度，Vn为接受池容积，Vi为取样量体积，A为扩散面积。

以累积渗透量(Q)为纵坐标，时间(t)为横坐标，绘制24 h的体外经皮渗透曲线，见图2。

250200150100500Q/(μg?cm-2)101520253005t/h透皮吸收试验贮库效应试验

图2蛇床子素脂质体凝胶的24 h体外经皮渗透曲线

Figure 2The absorption curves of osthole liposome gel within 24 hours(n=6)

以单位面积累积渗透量(Q)对时间(t)分别进行零级、一级、Higuchi方程拟合，直线的斜率即为透皮速率常数(J)，以相关系数r为方程拟合的判断标准，结果表明Higuchi方程拟合结果较好。蛇床子素脂质体凝胶剂0～24 h的透皮吸收回归方程为Q1=46.034t1/2-44.515，r=0.986 6,渗透速率为46.034 μg/h，24 h后的皮肤累积渗透量达172.95 μg/cm2。贮库效应试验的回归方程为Q2=48.155t1/2-12.03，r=0.986 6,渗透速率为48.155 μg/h，24 h后的皮肤累积渗透量达210.19 μg/cm2。

3讨论

体外透皮试验在经皮制剂处方筛选及相关影响因素考察等方面有重要应用价值，选择合理的体外透皮试验条件是准确反映药物透皮吸收特征的前提之一[8]。常用的透皮接收液为生理盐水、磷酸盐缓冲液,但对于脂溶性药物，接收液对药物的溶解性能很小，很快就达到饱和浓度而难以达到漏槽条件[8]，故需加入一定浓度的乙醇来增加药物溶解度。研究表明，由于蛇床子素为脂溶性药物[5]，乙醇浓度越高，经皮给药速率越快，但乙醇浓度过高时，会导致接收液挥发加快，而且还会对皮肤正常的生理结构产生一定的影响[8]，经前期考察，本文确定以生理盐水-乙醇溶液(体积比70∶30)为接受液。由于人体内部温度是37 ℃，故本文选择此温度为试验温度。由于扩散池容积和接收液用量固定，本课题组以往研究表明，转速在100～200 r/min之间，药物的透皮速率常数和累积渗透量并无明显差异[9]，因此本文将转速确定为200 r/min。

蛇床子素是香豆素类化合物,不易溶解在水中,卡波姆凝胶又具有生物亲和性,而脂质体和皮肤为磷脂双分子层,使蛇床子素从脂质体凝胶制剂中扩散出来,透过小鼠皮肤进入到吸收池中[10]。将蛇床子素制备成蛇床子素脂质体凝胶剂作用于皮肤,能有效地治疗皮肤疾病。卡波姆-940作为凝胶剂基质用于经皮给药具有易涂布、易水洗、无皮肤毒性、可吸收汗腺分泌物等特点[11]，是一种较理想的经皮给药基质，可有效提高药物的渗透性，使药物起到有效缓释作用。本文结果表明,蛇床子素脂质体凝胶的累积渗透量随着时间的增加而增大，从经皮渗透曲线来看，猜测透皮试验结束后，有部分蛇床子素贮存在皮肤中，从而导致贮库试验中蛇床子素的渗透率和皮肤累积渗透量增高，初步判断蛇床子素脂质体凝胶剂有贮库作用，从趋势上来看，2次试验的模型基本保持一致，且10～24 h达到稳态，提示制备体外透皮制剂时可以做成缓释制剂。蛇床子素脂质体凝胶剂对药物有缓释作用,既能提高药物的安全性，又可延长药物作用时间，提高药效。以上研究为蛇床子素脂质体凝胶的开发提供了依据，为扩大其临床应用提供了新思路。

参考文献:

[1] PIERRE M B,SANTOS M C.Liposomal systems as drug delivery vehicles for dermal and transdermal applications [J].Arch Dermatol Res,2011,303(9):607-621.

[2] 熊欣,刘淑芝,顼佳音，等.新型载体经皮凝胶剂的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(22):244-249.

[3] 于鹏霞,喻婉莹,阚伟娟，等.蛇床子素的抗炎作用及其机制[J]. 时珍国医国药,2012,23(4):866-868.

[4] 张秀岭，孟静岩.自拟祛风止痒汤治疗肛门湿疹58例[J].陕西中医，2014，35(6)：717-718.

[5] 胡小娟,陈维良,俞洋，等.N-脂肪酰-N-三甲基壳聚糖的合成及其对蛇床子素的增溶作用[J].中草药,2013,44(6):674-680.

[6] YUN F,KANG A,SHAN J,et al.A rapid and sensitive LC-MS/MS method for the determination of osthole in rat plasma: application to pharmacokinetic study[J].Biomed Chromatogr,2013,27(5):676-680.

[7] 赖滢滢,王岩,张英丰.星点设计-效应面法进行蛇床子素脂质体处方优化的研究[J].中国新药杂志,2015，24(6):708-712.

[8] 兰颐,王琼,安静,等.接受液中的乙醇浓度对药物体外透皮试验的影响[J].中国中药杂志,2013,38(16):2597-2600.

[9] 张英丰. 青藤碱贴剂透皮吸收实验接收液的筛选[J]. 现代医药卫生，2010，26(16):2403.

[10] 梁学政,奉建芳,陈惠红,等.双柏凝胶剂中大黄素体外透皮吸收的实验研究[J].时珍国医国药,2010,21(1):160-161.

[11] 芦洁,祝林,金鸿莱，等.盐酸多西环素脂质体凝胶剂的制备与评价[J].中国医药工业杂志,2006，37(2):93-95.

(责任编辑：陈翔)

Preparation of osthole liposome gel and preliminary study on itsinvitrotransdermal experiments

LAI Yingying1,ZHOU Ruopeng2,ZHANG Yingfeng3,WANG Yan1

(1．SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.GuangzhouKeygenesMedicineSci&TechCompanyLimited，Guangzhou510663，China；3.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To prepare the osthole liposome gel and evaluate the skin storage effect and the cumulative penetration in vitro. Methods The osthole liposomes were prepared by using the thin film dispersion method, and the Carbopol-940 was added as matrix for the preparation of the osthole liposome gel. In vitro transdermal experiments were done by Franz diffusion pool method. The cumulative release of osthole was determined by HPLC method to evaluate the drug absorption performance of osthole liposome gel. Results The absorption curve of osthole liposome gel was consistent with Higuchi function. The cumulative penetration of osthole liposome gel in 24 hours was 172.95 μg/cm2 in vitro transdermal experiments，while the cumulative penetration was 210.19 μg/cm2 in skin library storage experiments. Conclusion Osthole liposome gel can be absorbed through the skin with long-acting slow-release effect, and this experiment can provide a reference for the development of osthole transdermal preparations.

Key words:osthole; liposome gel; in vitro transdermal experiment

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015110203

中图分类号：R944

文献标志码：A

文章编号:1006-8783(2016)01-0005-04

作者简介：赖滢滢(1990—)，女，2013级硕士研究生，Email:609621147@qq.com;通信作者：王岩(1972—)，男，硕士生导师，教授，从事药物新剂型与新技术研究，Email:gdpuwy@126.com。

收稿日期：2015-11-02

网络出版时间：2016-01-18 9:42网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160118.0942.001.html