超高效液相色谱法快速测定复方丹参片中皂苷类成分的含量

吴立蓉，王秀凤，高卫东，唐小娅

(1.广东药学院 药用生物活性物质研究所，广东 广州 510006； 2.广东药学院 基础学院，广东 广州 510006； 3.佛山市食品药品检验检测中心，广东 佛山 528000)



药物分析

超高效液相色谱法快速测定复方丹参片中皂苷类成分的含量

吴立蓉1，2，王秀凤2，高卫东3，唐小娅2

(1.广东药学院 药用生物活性物质研究所，广东 广州 510006； 2.广东药学院 基础学院，广东 广州 510006； 3.佛山市食品药品检验检测中心，广东 佛山 528000)

摘要:目的 建立超高效液相色谱(UPLC)法测定复方丹参片中4种皂苷成分的质量分数。方法 采用超高效液相色谱法，色谱柱为Acquity BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相为乙腈-水，梯度洗脱；流速为0.5 mL/min；检测波长为203 nm；柱温为30 ℃。结果 复方丹参片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1在12 min内获得完全分离。各成分在定量范围内均呈良好的线性关系(r≥0.999)，平均回收率为98.9%～102.2%。结论 UPLC法与HPLC法同时测定同一批样品，测得的质量分数结果RSD值为0.01%。UPLC法提高了常规液相分析三七皂苷的速度，节约了溶剂。

关键词:超高效液相色谱法； 复方丹参片； 皂苷

超高效液相色谱(UPLC)法近年来作为一种新技术，与传统的高效液相色谱(HPLC)法相比，具有检测快速、高灵敏度、高分离度的优点，可大大缩短分析时间，同时减少溶剂用量以降低分析成本，目前在药物分析、生化分析、食品及环境分析等领域应用较广。

复方丹参片由丹参、三七、冰片3味中药组成，具有活血化瘀、理气止痛的功效，《中国药典》法定测定其中4种皂苷类成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的质量分数采用普通高效液相色谱法，耗时100 min，分析时间长、效率低[1]。有文献报道采用UPLC法测定复方丹参片中3种皂苷类成分的质量分数[2]，但是按照《中国药典》规定[1]，只3种成分的测定无法用于复方丹参片在生产流通过程中的质量控制,无实际应用价值。因此本研究参照文献[3-5]，采用UPLC法测定复方丹参片中4种皂苷类成分的质量分数，约10 min可以完成整个测定过程，极大地缩短了时间，提高了分析效率，可以在药品生产过程中产品质量控制以及药品流通过程中监督检验等方面产生较大的经济与社会效益。

1仪器与试药

Waters Acquity UPLC系统(四元泵处理器、自动进样器、柱温箱、PDA检测器)；Millipore超纯水机(美国默克密理博公司)。

三七皂苷R1(批号：110745-200414)、人参皂苷Rg1(批号：110703-201128)、人参皂苷Re(批号：110754-201123)、人参皂苷Rb1(批号：110704-201122)对照品购于中国药品生物制品检定所。乙腈为色谱纯(Merck公司)，水为超纯水。

复方丹参片(云南白药集团股份有限公司，批号：3140918)。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Acquity BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)； 流动相：乙腈-水，梯度洗脱；流速：0.5 mL/min；检测波长：203 nm；柱温：30 ℃；进样量：1 μL。梯度洗脱程序见表1，色谱图见图1，各成分分离度皆大于1.5。

表1复方丹参片中4种皂苷类成分测定的梯度洗脱表

Table 1Gradient elution of four components in compound Salvia tablets

t/minφ(乙腈)/%φ(H2O)/%0.00～2.0082.018.02.00～5.0082.0→80.018.0→20.05.00～11.0080.0→60.020.0→40.011.00～11.1060.0→82.040.0→18.011.10～12.0082.018.0

AB0.080.060.040.020.000.080.060.040.020.0043211234024681012t/minAUAU

1.三七皂苷R1； 2.人参皂苷Rg1； 3.人参皂苷Re； 4.人参皂苷Rb1。

图1混合对照品(A)、复方丹参片供试品(B)溶液的UPLC色谱图

Figure 1UPLC chromatograms of mixed references(A) and compound Salvia tablets(B)

2.2混合对照品溶液的制备

精密称取对照品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1适量，加70%(体积分数，下同)甲醇制成每1 mL含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re及人参皂苷Rb1分别为0.050、0.200、0.051、0.202 mg的混合对照品溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备

取复方丹参片10片，除去包衣，精密称定，研细，取约1 g，精密称定，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量。超声处理(功率250 W，频率33 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4线性关系的考察

分别精密称取对照品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1适量，加70%甲醇制成每1 mL含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re及人参皂苷Rb1分别为0.20、0.40、0.20、0.40 mg的混合对照品溶液，备用。精密量取上述对照品混合溶液各1、2、4、6、8 mL，分别置10 mL容量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度。分别精密吸取1 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，每个样品进样2次。以对照品质量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标进行线性回归，得出三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的回归方程分别为Y1=6.120 08×105X1+3.619 1×102，r1=0.999 5；Y2= 5.912 95×105X2+1.492 2×102，r2=0.999 9；Y3= 6.867 12×105X3-1.415 7×102，r3=0.999 7；Y4=5.081 59×105X4+9.619 1×102，r4=0.999 9。结果表明4种皂苷类成分进样量分别在0.02～0.16 μg、0.04～0.32 μg、0.02～0.16 μg、0.04～0.32 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5精密度试验

取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下条件重复测定5次，分别计算4种成分的峰面积积分值。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰面积的RSD 值分别为0.09%、0.04%、0.08%、0.04%，表明仪器精密度良好。

2.6重复性试验

取同一批(批号：3140918)复方丹参片，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，共5份，每份平行测定2次，按“2.1”项下条件测定并计算各成分的质量分数。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1质量分数的RSD值分别为1.13%、0.95%、1.01%、1.00%。

2.7稳定性试验

取同一批(批号：3140918)供试品溶液，分别在制备后0、2、4、8、12、24 h进样，按“2.1”项下测定并计算各成分峰面积的RSD值，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰面积的RSD值分别为0.40%、0.15%、0.37%、0.25%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8加样回收率试验

取复方丹参片粉末6份，每份约0.5 g，精密称取，加入三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1质量浓度分别0.25、1.0、0.1、0.8 mg/mL的混合对照品溶液1 mL，按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下测定并计算回收率。结果测得回收率为98.85%～102.24%，RSD值为1.12%～1.99%。见表2。

2.9UPLC法与HPLC法测定结果的统计分析

取复方丹参片样品适量，分别按上述UPLC法与HPLC法[1]测定其中4种皂苷类成分的总质量分数，平行测量7次。测定结果见表3。

表2　复方丹参片中4种皂苷类成分的回收率试验结果

表3UPLC法与HPLC法测定复方丹参片中4种皂苷类成分总质量分数的结果比较

Table 3Determination results of four saponins with UPLC and HPLC in compound Salvia tablets

w/(mg·g-1)

采用两样本均值间的t检验进行数据分析。根据公式：

(1)

(2)

计算，得t=0.431。查t检验临界值表得知，双侧检验t0.05,10=2.228，t

3讨论

为保证与《中国药典》规定的一致性，本试验的供试品溶液提取方法、测定波长与药典规定一致，同时考察了色谱条件的流动相组成、柱温和流速等。用所建立的UPLC法测定复方丹参片中各成分质量分数，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1色谱峰与相邻峰的分离度均大于1.5，符合药典要求。

比较了UPLC法与HPLC法所测样品质量分数的数据，通过统计分析得知，这2种分析方法所测得的均值差异无统计学意义，因此可用UPLC法替代HPLC法测定复方丹参片中4种皂苷类成分的质量分数。

与药典增补方法需要的100min相比，本UPLC法极大地缩短了时间，提高了分析效率，在12min内即可将复方丹参片中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb14种待测成分完全分离，可以代替常规HPLC法进行测定，在药品生产过程产品质量控制以及药品流通过程监督检验等方面产生较大的经济效益和社会效益。

参考文献:

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版第一增补本[M].北京：中国医药科技出版社，2010：201-202.

[2] 罗峰，崔永霞，沈晓明，等.超高效液相色谱法测定复方丹参片中三种皂苷类成分的含量[J].中医学报,2015,30(4):551-553.

[3] 谢耀轩,林亚珠.超高效液相色谱法测定三七中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[J].广东药学院学报,2011,27(5):489-492.

[4] 姜涛,陈林明,林岱滨.超高效液相色谱法测定三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的方法研究[J].中国现代药物应用,2014，8(20):15-16.

[5] 吴健,高家荣,吴小明,等.超高效液相色谱法同时测定复方守宫散中皂苷类含量[J].中国医院药学杂志,2014,34(8):647-649.

(责任编辑：刘晓涵)

Simultaneous determination of four components in compound Salvia tablets by UPLC analysis

WU Lirong1，2,WANG Xiufeng2,GAO Weidong3,TANG Xiaoya2

(1.InstituteofPharmaceuticalBioactiveSubstanceResearch,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofBasicCourses,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;3.FoshanCenterforFoodandDrugControl，Foshan528000，China)

Abstract:Objective To develop a novel and rapid method with ultra-performance liquid chromatography for the simultaneous determination of four saponins in compound Salvia tablets. Methods An acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm) was used. Acetonitrile and water were adopted with gradient elution of 0.5 mL/min,and the detection wavelength was 203 nm. The column temperature was 30 ℃. Results Notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1,Re and Rb1 in compound Salvia tablets had good linearity. And the average recoveries were among 98.9%-102.2% (n=6). Conclusion The relative deviation of the content was 0.01% when UPLC and HPLC was used to determine the same sample. UPLC could greatly improve the separation efficiency and reduce the solvent consumption. As an alternative of conventional HPLC,UPLC is more convenient,rapid and feasible.

Key words:UPLC； compound Salvia tablets；saponins

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015110201

中图分类号:R284.1

文献标志码：A

文章编号:1006-8783(2016)01-0032-04

作者简介：吴立蓉(1980—)，女，博士，副研究员，主要从事中药复方抗衰老及药品质量标准的研究，Email：30872950@qq.com；通信作者：唐小娅(1980—)，Email：526325348@qq.com。

基金项目:国家自然科学基金项目(81403153)；广东省省级科技计划项目(2014A020212603)

收稿日期：2015-11-02

网络出版时间：2016-01-15 18:36网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160115.1836.010.html