艾灸预处理对急性力竭运动大鼠心肌损伤及蛋白激酶C的影响

熊　英　顾一煌　吴云川

(南京中医药大学中医学一级学科，江苏　南京　210046)



艾灸预处理对急性力竭运动大鼠心肌损伤及蛋白激酶C的影响

熊英顾一煌吴云川

(南京中医药大学中医学一级学科，江苏南京210046)

〔摘要〕目的探讨艾灸预处理对急性力竭运动导致的心肌损伤的保护作用及蛋白激酶C(PKC)的影响。方法健康雄性SD雄性大鼠40只，随机分为正常对照组(C组)、艾灸组(M组)、力竭组(E组)、艾灸力竭组(ME组)和艾灸力竭+PKC抑制剂组(ME+CHE组)5组。在一次性游泳急性力竭模型的基础上，用艾灸预处理进行干预，并注射PKC抑制剂白屈菜红碱(CHE)，采用透射电镜观察心肌细胞超微结构的变化，运用酶联免疫吸附(ELISA)法检测大鼠心肌PKC蛋白水平及其活化情况。结果①E组心肌超微结构损伤改变明显，ME组心肌超微结构损伤较E组轻，而ME+CHE组心肌超微结构损伤程度与E组相似。②与C组比较，M组和ME组PKC蛋白水平无明显变化，E组和ME+CHE组p-PKC水平均有明显升高(P<0.05)；与E组比较，ME组PKC水平有明显下降(P<0.05)，ME+CHE组水平无明显变化；与ME组比较，ME+CHE组PKC水平有明显上升(P<0.05)。③与C组p-PKC水平比较，M组无明显变化，E组、ME组和ME+CHE组水平均有明显升高(P<0.05)；与E组比较，ME组p-PKC水平有明显下降(P<0.05)；与ME组比较，ME+CHE组P-PKC水平有明显上升(P<0.05)。结论急性力竭运动所致的心肌损伤与PKC的过度表达和活化有关，艾灸预处理对急性力竭所致的心肌损伤有保护作用，阻止PKC的过度表达和活化可能是其起效的机制之一。

〔关键词〕艾灸；预处理；心肌超微结构；蛋白激酶C(PKC)

艾灸是祖国医学“治未病”的常用手段，早在古代即有艾灸防治心血管疾病的大量记载，本实验也证实艾灸预处理对运动性心肌损伤有一定的防治作用。蛋白激酶C(PKC)是预处理心肌保护效应中重要的中介物质之一〔1〕，但也有研究表明PKC过度活化可加重心肌缺血再灌注(I/R)损伤的程度〔2〕。鉴于以往的研究结果，本研究在大鼠急性力竭游泳运动模型的基础上，运用艾灸预处理进行干预，并使用PKC抑制剂白屈菜红碱(CHE)，观察艾灸预处理对急性力竭大鼠心肌损伤的保护作用及心肌PKC表达及活化的影响。

1材料与方法

1.1实验动物选用健康雄性SD大鼠37只，体重190~210 g。大鼠常规分笼饲养，一组一笼，均以标准啮齿类动物饲料饲养，自由饮食。室温保持在20℃～22℃，相对湿度45%～50%，光照时间为12 h/d。大鼠参照随机数字表分为5组，包括正常对照组(C 组，n=7)、艾灸组(M组，n=8)、力竭组(E组，n=6)、艾灸力竭组(ME组，n=8)、艾灸力竭+CHE组(ME+CHE组，n=8)。

1.2力竭模型的建立力竭模型参照彭泽胄等〔3〕的文献报道，先进行2 d适应性游泳(20 min/次)，而后进行一次性力竭游泳运动，游泳大鼠尾部负重为体重3%，直至力竭。力竭标准：连续沉入水中超过10 s，捞出后置于平面不能完成翻正反射。在相对较短时间内力竭的大鼠，将其捞出休息5 min后，再继续进行游泳运动，使每次运动时间不少于2 h。游泳后，迅速用干毛巾擦干水分，电吹风吹干后，放回笼中休息。

1.3分组所有大鼠进入动物房后，先适应性喂养3 d，各组在同一时间取材。C组：在E组大鼠力竭游泳前，适应性游泳2 d，次日麻醉取材。M组：从E组大鼠游泳前7 d开始，进行艾灸预处理，取大鼠单侧“内关”、“足三里”，两侧轮换，每穴各灸15 min，共灸30 min，每天1次，其他无特殊处理，艾灸第6、7天进行适应性游泳，次日麻醉取材。E组：在大鼠力竭游泳前，适应性游泳2 d，次日一次性游泳至力竭，在训练结束30 min后进行取材。ME组：训练方案同E组，从力竭游泳前7 d开始进行艾灸预处理，方法同M组，艾灸第6、7天进行适应性游泳，次日进行一次性游泳至力竭。在训练结束30 min后进行取材。ME+CHE组:处理同ME组，但每天在艾灸前给大鼠腹腔注射CHE(5 mg/kg)，而后开始艾灸。

1.4取材和电镜标本制备将大鼠用0.4%戊巴比妥钠(1 ml/100 g体重)腹腔注射麻醉后，呈仰卧位固定，打开胸腔，暴露心脏，取出心脏，取左心室心尖心内膜下组织1 mm3，3%戊二醛固定和1%锇酸后固定(4℃)，逐级酒精-丙酮脱水，Epon812树脂包埋，0.5%美蓝染色，半薄定位。超薄切片机切片，切片厚50~60 nm，醋酸铀-柠檬酸铅复染，制成电镜标本，在Hitach1透射电镜下观察摄片。

1.5ELISA法检测PKC及p-PKC蛋白表达取样品在4℃10 000 r/min离心5 min，取上清，用 BCA 法对蛋白浓度进行测定，采用 ELISA法在酶标仪上读出 OD 值，所有 OD 值减去除零孔值后再行计算。以标准品的 OD 值使用相应软件绘制出标准曲线，计算样品含量。

1.6数据处理采用SPSS11.5软件行单因素方差分析、LSD检验，方差不齐用DunnettT3进行检验。

2结果

2.1各组心肌细胞透射电镜观察结果C组心肌细胞超微结

构正常，肌膜完整，肌原纤维排列规则，线粒体呈带状分布，排列整齐，形态正常，嵴清晰。M组与C组没有明显差异。E组心肌超微结构改变明显，细胞膜虽完整，但肌原纤维排列不规则并有断裂处，纤维间空隙增大，线粒体肿胀严重，或线粒体溶解破裂，呈空泡状，嵴消失。ME组心肌超微结构损伤较E组程度减轻，细胞膜完整，肌原纤维排列较规则，但间隙较大，线粒体肿胀减轻，嵴较清晰。而ME+CHE组心肌超微结构也有明显改变，其损伤程度与E组相似。见图1。

2.2ELISA法检测各组心肌组织PKC及p-PKC蛋白含量与C组比较，M组PKC蛋白水平无明显变化，ME组水平虽有上升，但与C组没有明显差异，E组和ME+CHE组PKC水平均有明显升高(P<0.05)；与E组比较，ME组PKC水平有明显下降(P<0.05)，ME+CHE组水平无明显变化；与ME组比较，ME+CHE组PKC水平有明显上升(P<0.05)。大鼠心肌p-PKC的ELISA检测结果比较(见表1)，与C组比较，M组p-PKC蛋白水平虽有上升，但无明显差异，E组、ME组和ME+CHE组水平均有明显升高(P<0.05)；与E组比较，ME组p-PKC水平有明显下降(P<0.05)，ME+CHE组水平无明显变化；与ME组比较，ME+CHE组PKC水平有明显上升(P<0.05)。见表1。

表1　大鼠心肌组织PKC及p-PKC蛋白水平

1)与C组比较，2)与E组比较，3)与ME组比较：P<0.05

图1　各组心肌细胞透射电镜观察结果(×2 000)

3讨论

超负荷训练的运动量可能接近极度的疲劳或力竭，也是导致运动员猝死的原因之一〔4,5〕。研究认为运动训练中，心脏肯定存在缺血、缺氧现象，但在其自我保护机制的作用下不会使心肌损伤，而一旦运动负荷超出了机体的防御能力与心脏的耐受，可造成心肌损伤。急性力竭运动可使心肌出现脂质过氧化加强、钙离子(Ca2+)超载等现象，致心肌损伤。由于运动后心肌损伤的时相性变化与临床上心肌I/R损伤的改变一致，故这种心肌损伤又称为运动性I/R损伤〔6〕。

预处理可以调动机体内源性保护机制，对一些疾病起到预防和治疗的作用。1986年Murry等〔7〕提出缺血预处理对心脏有保护作用以来,人们开始通过各种预处理手段来调动脏器内源性保护作用。艾灸预处理又被称为“逆灸”，是中医“治未病”的重要内容，“无病而先针灸曰逆。逆,未至而迎之也”。早在古代即有艾灸防治心血管疾病的大量记载，现代研究亦表明艾灸对于心肌I/R具有保护作用〔8〕。本课题组在前期的研究中也发现艾灸能通过提高大鼠的心肌抗氧化能力，从而对心肌损伤有一定的保护作用〔9〕。

本实验结果提示，力竭运动导致心肌细胞超微结构损伤、心肌细胞肿胀、线粒体呈现空泡状、嵴消失。而艾灸预处理后对力竭运动大鼠的心肌细胞有一定的保护作用，可见心肌细胞肿胀及线粒体的损伤程度等均比力竭大鼠有明显的减轻，但艾灸预处理对没有参与力竭的大鼠心肌无明显影响。PKC是预适应心肌保护效应中重要的中介物质之一。近年研究表明,PKC的激活、转位介导了心肌缺血预处理效应,而其抑制剂则能消除此种保护效果〔10〕,故而有人提出PKC介导的预处理中蛋白磷酸化可能是预处理细胞保护作用的重要环节,早期的PKC活化即在整个预处理中起关键作用。但艾灸预处理如何影响急性力衰运动中心肌PKC的表达活化还不得而知。

本研究结果显示，力竭运动导致大鼠心肌PKC及p-PKC蛋白水平均有显著升高，而艾灸预处理使其蛋白水平均有显著降低。已有研究表明，虽然δPKC的活化是IP发挥心肌保护效应的环节之一，但过度活化可加重心肌I/R损伤的程度，抑制心肌I/R时再灌注期的δPKC活性可以缓解心肌的损伤〔11~13〕;而过度表达和活化的αPKC也会使心肌收缩能力受损而加重心肌损伤〔14〕。所以，推测，PKC含量过多及活化过度可能是其导致急性力竭运动后心肌损伤的机制之一，而艾灸预处理能抑制过度升高及活化的PKC，而对心肌损伤产生一定的保护作用。由于自由基是 PKC 调控中的关键物质之一，而前期的研究也表明艾灸能通过提高大鼠的心肌抗氧化能力，对心肌损伤有一定的保护作用〔9〕，所以笔者认为，艾灸预处理可能通过改善力竭运动心肌的氧化应激状态而使PKC及其活化水平降低。

CHE是PKC的选择性抑制剂，可与 PKC 的催化部位结合而使其失活，抑制PKC的磷酸化〔15〕。在本研究中，注射CHE使艾灸预处理后力竭大鼠心肌PKC及p-PKC蛋白的表达明显升高，提示CHE抑制了艾灸预处理后大鼠PKC及 p-PKC蛋白表达的下降，这可能是其导致艾灸预处理心肌保护作用消失的主要原因。有研究发现，PKC抑制剂 CHE 能阻断大鼠在运动预适应即刻和24 h δPKC下降的趋势〔16〕，这与本研究的结果有相似之处，不过预处理手段截然不同。

另有研究证实CHE还有其独立的生物学作用，CHE 能诱导自由基的产生，而此过程与抑制PKC无关；而且其诱导自由基的产生所致大鼠心肌凋亡的作用比抑制 PKC 的作用更显著，而自由基又是促进PKC活化的重要物质〔17~19〕。

本研究中注射 CHE 后使艾灸预处理的力竭大鼠心肌PKC蛋白表达和活化增加，笔者推测可能是一方面由于 CHE 阻断PKC 活性后致PKC 在膜上的停留时间增加，同时诱导PKC 蛋白的进一步表达，使PKC 补偿性增多；另一方面由于CHE独立诱导自由基产生，促使PKC水平和活化增加，从而使艾灸预处理作用不能正常发挥。

综上，急性力竭游泳运动造成大鼠一定程度的心肌损伤，艾灸预处理对正常大鼠没有明显影响，但能一定程度保护力竭运动大鼠的心肌，而注射CHE会影响艾灸预处理对心肌的保护作用。力竭运动导致心肌PKC的过度表达和活化，可能是心肌损伤的机制之一，艾灸预处理明显抑制过度表达的PKC及其活化，可能是艾灸预处理心肌保护的机制之一，CHE显著阻碍了艾灸预处理对PKC水平升高及其活化的抑制作用，其机制可能与其补偿性增加和独立诱导自由基的作用相关。

4参考文献

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〔2014-12-03修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

〔中图分类号〕R245

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)07-1575-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.017

基金项目：江苏高校优势学科建设工程资助项目(2014年)；南京中医药大学中医学一级学科开放课题资助(YS2012ZYX407)；江苏省高校自然科学研究面上资助项目(11KJB360005)

第一作者：熊英(1975-)，女，博士，副教授，硕士生导师，主要从事针灸推拿研究。