脂多糖对原代大鼠腹膜间皮细胞IL-1β和IL-6表达的影响

曾　莉　乐音子　李文林　颜　帅　卞尧尧　宗　阳

(南京中医药大学，江苏　南京　210023)



脂多糖对原代大鼠腹膜间皮细胞IL-1β和IL-6表达的影响

曾莉乐音子1李文林颜帅1卞尧尧宗阳

(南京中医药大学，江苏南京210023)

〔摘要〕目的研究原代腹膜间皮细胞(PMCs)对不同浓度脂多糖(LPS)刺激的反应效果，探讨术后腹腔粘连体外细胞最佳造模方法。方法运用不同浓度LPS于不同时间点刺激PMCs，ELISA法检测各组细胞上清液中白介素(IL)-1β、IL-6蛋白含量，qRT-PCR检测IL-1β、IL-6 mRNA水平，扫描电镜观察LPS刺激前后PMCs的活性变化情况。结果ELISA测得各组大鼠PMCs培养上清液IL-1β和IL-6浓度随着培养时间推移和LPS浓度增加而表现出明显差异(P<0.01)，尤其以24 h、10 μg/ml为LPS最佳刺激时间和最佳刺激浓度；qRT-PCR实验中 LPS最佳刺激时间为24 h，但是最佳刺激浓度为5 μg/ml；正常PMCs扫描电镜下表面被丰富的微绒毛覆盖；LPS刺激后PMCs剥脱、肿胀明显，具有细胞间隙，偶见基底膜。结论LPS能够刺激大鼠PMCs诱发炎症损伤，进一步放大炎症反应，模拟术后腹腔粘连微环境，作为术后腹腔粘连体外细胞模型。

〔关键词〕腹腔粘连；腹膜间皮细胞；IL-1β；IL-6；脂多糖

腹膜间皮细胞(PMCs)具有调节、合成纤溶成分，分泌多种细胞因子以维持腹腔内局部微环境的作用。PMCs的完整性及功能正常与否是腹腔粘连形成的关键因素〔1〕。术后氧化应激和炎症因子等因素的影响下，PMCs增殖和修复的数目与术后腹腔粘连程度呈正相关。本实验拟以脂多糖(LPS)刺激PMCs，观察并探讨大鼠PMCs对LPS的刺激效果，寻找腹腔粘连体外模型最佳造模方法以及LPS的最佳刺激时间和剂量。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物雄性清洁级别SD 大鼠(原代细胞用)，体质量 160~180 g，由上海杰思捷实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(沪)2012-0006。

1.1.2试剂DMEM/F12培养基(LOT：8113397，Gibco)，胎牛血清(LOT：1133067，Gibco)，青霉素、链霉素(Gibco)，LPs(Escherichia coli 0111：B4，L4391-1MG，Sigma，USA)，D-Hank液体(LOT：8113400，Gibco),0.25% 胰蛋白酶-EDTA(南京凯基生物科技发展有限公司)，大鼠白介素(IL)-1β、IL-6 ELISA试剂盒(上海巧伊生物科技有限公司)，多聚甲醛(天津市科密欧化学试剂有限公司)，多聚赖氨酸(Sigma)，红细胞裂解液(南京凯基生物科技有限公司)，乙醚(上海凌峰化学试剂有限公司)，总RNA快速提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，逆转录试剂盒(Thermo Scientific Fisher公司)，qPCR SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)(TIANGEN)，灭菌注射用水(安徽双鹤药业有限责任公司)，RNAiso Plus(Takara Bio Inc)，PBS缓冲液(自配)。各种免疫组化染色一抗、抗角蛋白(Keratin)抗体、抗波形蛋白(Vitamin)抗体、抗白细胞CD45 抗体、抗第Ⅷ因子(Factor Ⅷ)抗体及 SABC 试剂盒(武汉博士德公司)。

1.1.3仪器50 ml一次性使用无菌注射器(江苏华达医疗器械有限公司)，一次性使用医用橡胶检查手套(江苏镇江华扬乳胶制品有限公司)，CPA224S电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，自动洗板机(江苏华东电子)，电恒水浴锅、精密鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，CKX31倒置式生物显微镜(日本 OLYMPUS公司)，精密移液器、常温低速离心机(德国 Eppendorf 公司)，垂直流超净工作台(新加坡艺思高科技有限公司)，CO2恒温培养箱(美国Thermo Scientific公司)，Synergy 2全自动酶标仪(美国 Bio-Tek公司)，纯水仪(美国Millipore公司)，全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司)，25 cm2培养瓶、96孔培养板(美国Coring公司)，一次性无菌移液管(规格2.5 ml，北京汉宸创展科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞的培养、传代及鉴定细胞实验前1 d，用终浓度为0.01 mg/ml多聚赖氨酸(200 μl 1 mg/ml多聚赖氨酸+1.8 ml PBS)铺于CO2培养瓶中，置于37℃，5% CO2，湿度为95%的培养箱中静置培养30 min，然后将其移至超净台风干，4℃下储存备用。参考文献〔2~4〕基础上，无菌棉球浸于3~5 ml乙醚原液，丢入真空干燥器中。将大鼠放置于真空干燥器中，3 min后大鼠站立失衡，全身瘫软(注意勿使大鼠吸入过多乙醚致死)。取出大鼠，碘伏消毒腹部皮肤3遍，75%乙醇脱碘3遍后，无菌纱布擦干，将25~30 ml 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA 消化液沿腹正中线偏右侧进针腹腔注射，75%乙醇浸泡10 min，2 h后超净台中无菌打开腹腔，无菌吸管吸取腹腔液至15 ml离心管，若肉眼可见红细胞，则加入1~2倍体积的红细胞裂解液冰上裂解2 min，D-Hank液清洗，1 500 r/min离心10 min，弃上清，D-Hank液将细胞洗一遍，离心弃上清，以含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，37℃，5% CO2，湿度为95%的培养箱中静置培养。24 h后，细胞基本贴壁，3 d后细胞完全贴壁后可换液，以后每2 d换液1次，约培养5~7 d细胞融合至90%以上后可传代培养。3 d后首次换液，以后根据细胞生长状态每2~3 d换液1次，取第2代细胞经倒置显微镜观察并采用免疫组化方法对大鼠腹膜间皮细胞进行抗角蛋白、抗波形蛋白抗体、抗白细胞CD45抗体、抗第Ⅷ因子等相关抗原鉴定。取第3代细胞用于实验。

1.2.2扫描电镜制备使大鼠PMCs生长在被多聚赖氨酸包被的0.5 cm×0.5 cm大小的载玻片上，4℃ PBS洗3次，2.5%的戊二醛固定液4℃固定2 h，4℃下PBS反复冲洗2次，每次5 min，1%锇酸溶液固定4 h，4℃ PBS反复冲洗2次，50%、70%、90%及100%乙醇逐级脱水，每次5 min，临界点干燥样品，离子溅射，真空喷镀金后进行扫描电镜观察细胞表面形态。

1.2.3分组与处理选取状态良好的对数生长期大鼠PMCs，0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，调整细胞浓度，第3代大鼠PMCs以 1×106/ml接种于六孔培养板中，每孔加入2 ml DMEM/F12 培养液，置培养箱中培养，待PMCs融合度至90%时，更换0.5 % 胎牛血清的 DMEM/F12培养液以同步化24 h后，使参照文献〔5~8〕随机分组：①正常对照组：只含DMEM/F12培养液；②1 μg/ml组：加含终浓度为LPS 1 μg/ml、DMEM/F12培养液；③5 μg/ml组：加含终浓度为LPS 5 μg/ml、DMEM/F12培养液；④10 μg/ml组：加含终浓度为LPS 10 μg/ml、DMEM/F12培养液；接种后将培养板放入37℃，5% CO2，湿度为95%的培养箱中静置培养，各组分别培养4、6、12、24 h后，细胞培养液上清和细胞分别用于后续检测。

1.2.4实时定量RT-PCR(qRT-PCR)检测各组细胞IL-1β和IL-6 mRNA的表达收集各组细胞约106~107，按照说明书利用Trizol试剂盒抽取细胞总RNA。定量逆转录PCR使用Ribolock TM cDNA 合成试剂盒。采用 SYBR Premix Ex Taq和 iQ5 实时定量 PCR检测系统(BioRad)。β-actin作为内对照。

β-actin引物正义：5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，反义：5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。IL-1β引物正义：5’-TCCTCTGTGACTCGTGGGAT-3’，反义：5’-TCAGACAGCACGAGGCATTT-3’。IL-6引物正义：5’-CACTTCACAAGTCGGAGGCT-3’，反义：5’-TCTGACAGTGCATCATCGCT-3’(上海桑尼生物科技有限公司合成)。逆转录反应：mRNA样品11 μl，Ribolock逆转录酶 1 μl，Ribolock反应混合物 4 μl，加无RNase 的双蒸水至20 μl，轻轻振荡混匀，25℃干浴5 min，42℃干浴60 min，70℃干浴5 min。实时定量PCR反应：cDNA逆转录8 μl，正反义引物各1 μl，SYBR预混剂10 μl。PCR反应程序：50℃，3 min；95℃，3 min；95℃，10 s；59℃，20 s；72℃，30 s；95℃，3 min；运行45个循环。每组设三个复孔，实验重复三次。采用Delta-delta Ct法分析目的基因的相对表达量，根据扩增的目的基因和管家基因的Ct值，利用下述公式计算所扩增的目的基因相对于管家基因的变化倍数。F=2-ΔΔCt，ΔΔCt=实验组(CT目的基因-CT内参)-对照组(CT 目的基因-CT内参)。

1.2.5采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞上清液中IL-1β和IL-6的含量收集各组不同条件下培养的PMCs上清液，以4 000 r/min，离心10 min，再取上清液于-80℃低温保存。严格按照 ELISA 试剂盒说明书测定细胞上清液中IL-1β、 IL-6 的含量，经过彻底洗涤后用底物四甲基联苯胺(TMB)显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-1β、 IL-6含量呈正相关，以此反映大鼠PMCs的IL-1β、 IL-6蛋白表达水平。显色后用酶标仪在450 nm波长下测定 OD 值，再以建立的标准曲线换算出检测指标的真实含量。

1.3统计学处理采用SPSS15.0软件行单因素方差分析，两两比较组间采用LSD法。

2结果

2.1倒置显微镜下观察大鼠PMCs在倒置显微镜下观察24 h后贴壁的大鼠原代细胞，培养初期呈梭形及椭圆形，1 w后融合成多边形细胞，外观如铺路鹅卵石样，为典型的PMCs的外形，形状多边形，大小形态较一致，见图1。

2.2免疫组化鉴定大鼠PMCs光镜下观察鉴定的细胞角蛋白和波形蛋白染色均呈棕色，而第Ⅷ因子相关抗原及CD45抗原染色均为阴性。见图1。

A，B：倒置显微镜下PMCs的形态；C：Keratin(+)；D：Vitamin(+)；E：CD45(-)；F：第Ⅷ因子(-)图1　原代PMCs培养形态及免疫组化鉴定图

2.3扫描电镜下LPS刺激前后大鼠PMCs变化情况正常大鼠PMCs的表面被丰富的微绒毛所覆盖，PMCs未见明显肿胀，细胞膜无凹陷；而LPS刺激后PMCs剥脱、肿胀明显，具有细胞间隙，偶见基底膜，见图2。

图2　LPS刺激前、后原代PMCs形态变化(×3 000)

2.4RT-PCR检测各组细胞中IL-1β、 IL-6 mRNA表达水平与NC组相比，LPS刺激4 h时仅有10 μg/ml LPS刺激组IL-1β mRNA表达具有统计学意义(P<0.05)。随着刺激浓度的递加，6 h时5、10 μg/ml LPS组与NC组相比具有统计学意义(P<0.05)，12 h时仅有5 μg/ml LPS刺激组与NC组相比具有差异；直至24 h，三个剂量组与NC组相比均有显著差异(P<0.01)，以5 μg/ml LPS刺激组最为明显，见表1。IL-6 mRNA在LPS刺激PMCs后，4 h三个刺激组均无明显变化(P>0.05)；与NC 组相比，6 h仅有5 μg/ml LPS组IL-6 mRNA有统计学差异(P<0.05)；12 h和24 h时IL-6 mRNA浓度随着LPS刺激量而逐渐升高(P<0.01)，见表2。

表1　不同时间点PMCs上清液IL-1β mRNA水平

与NC组相比：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

表2　不同时间点PMCs上清液IL-6 mRNA水平

2.5ELISA检测各组细胞中IL-1β、 IL-6蛋白表达水平见表3，

表3　不同时间点各组上清液IL-1β蛋白表达水平±s)

表4。IL-1β和IL-6浓度随着LPS的刺激量而逐渐升高，与同时间点NC组相比，以24 h时10 μg/ml组差异最明显(P<0.01)。

表4　不同时间点各组上清液IL-6蛋白表达水平±s)

3讨论

采用术后动物模型探讨腹腔粘连的发病机制，对于掌握腹腔粘连发病的细胞和分子学机制有其局限性，某种程度上制约研发及评价药物等治疗措施。因此，构建理想的腹腔粘连体外细胞模型是关键所在，可作为抗腹腔粘连手段筛选的重要工具。本实验以培养体系稳定的大鼠腹膜间皮细胞为对象，尽可能模拟术后腹腔粘连的致病因素和病理过程。PMCs作为腹腔粘连形成的重要细胞，是诸多细胞因子首先侵及的对象，PMCs的超微结构的破坏和凋亡直接决定腹腔粘连的程度，杨丽娜等〔5〕采用LPs作用于大鼠PMCs发现LPS能抑制大鼠PMCs增殖、促进其凋亡，与有关文献〔8〕研究结果一致。故本实验考虑采用LPs刺激大鼠PMCs构建细胞模型。

IL-6是一种类似生长或分化因子、刺激其他基因表达的一种多功能细胞因子，是组织损伤的早期标志，由间皮细胞中IL-1和TNF-α刺激分泌〔9，10〕。腹膜损伤后由巨噬细胞释放TNF-α和IL-6，在凝血调节和纤维蛋白形成中发挥重要的作用，直至粘连形成。与正常腹膜成纤维细胞相比，IL-6水平在粘连成纤维细胞显著升高〔11〕。当手术后机体暴露于缺氧状态，血浆中可溶性ICAM-1，TNF-α和IL-6细胞因子迅速升高〔12〕，腹腔液中IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α、TGF-β1等细胞因子水平也逐渐升高〔13，14〕，细胞层面上在正常腹膜成纤维细胞和黏附成纤维细胞IL-6水平均升高，但更大程度上是在正常成纤维细胞上升高明显〔11〕。IL-1在启动免疫反应中起着重要作用，且与腹腔粘连的发生发展密切相关。Saba等〔10〕研究表明IL-1和TNF-α可作为人腹腔粘连组织形成的生物标记物，且应用IL-1抗体可一定程度上减轻腹腔粘连的形成。

本研究表明，开腹前后PMCs形态学发生变化，手术损伤腹膜引起PMCs形态损伤，但损伤的程度未做统计学分析。24 h 10 μg/ml为LPS最佳刺激时间和最佳刺激浓度。而RT-PCR结果与ELISA结果并不完全一致，虽然LPS最佳刺激时间为24 h，但是最佳刺激浓度却为5 μg/ml。以DMEM/F12作为基础培养基，培养体系稳定、操作简单，细胞贴壁迅速，活力较高。不同浓度的LPS对大鼠PMCs的影响不同，随着LPS浓度的增加，PMCs活力变差，当LPS增加到5 μg/ml和10 μg/ml时候，PMCs活中的IL-1β和IL-6蛋白升至最高。分析其原因可能是基因变化要比蛋白表达快且敏感，因为存在转录后调控、翻译后修饰等，PCR结果往往和蛋白检测结果不一致。本实验采取LPS刺激PMCs，发现与上述文献报道结果相似，故可暂定腹腔粘连体外细胞模型构建成功。

4参考文献

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11Ambler DR，Fletcher NM，Diamond MP，etal.Effects of hypoxia on the expression of inflammatory markers IL-6 and TNF-α in human normal peritoneal and adhesion fibroblasts 〔J〕.Syst Biol Reprod Med，2012；58(6)：324-9.

12Salman B，Yilmaz TU，Tezcaner T，etal.Exogenous recombinant adiponectin improves survival in experimental abdominal sepsis 〔J〕.Balkan Med J，2014；31(3)：244-8.

13Dinarvand P，Hassanian SM，Weiler H，etal.Intraperitoneal administration of activated protein C prevents postsurgical adhesion band formation 〔J〕.Blood，2015；125(8)：1339-48.

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〔2015-11-19修回〕

(编辑李相军)

Effect of lipopolysaccharide on the expressions of IL-1β and IL-6 in rat peritoneal mesothelial cells

ZENG Li, LUE Yin-Zi,LI Wen-Lin,etal.

Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the stimulating effects of lipopolysacchride (LPS) on the expressions of IL-1β and IL-6 in rat peritoneal mesothelial cells(RPMCs).MethodsDifferent concentrations of LPS was used to stimulate RPMCs at different time points, the protein and mRNA levels of IL-Iβ, IL-6 were detected respectively by ELISA and qRT-PCR. Morphological changes were observed under scanning electron microscope.ResultsIL-Iβ and IL-6 concentrations were increased with the stimulation time and LPS concentration(P<0.01). The best stimulation time was 24 hours and the best stimulus concentration was 10 μg/ml. Normal RPMCs manifestations were covered by abundant microvilli. However, LPS stimulated RPMCs appear stripping, swelling significantly, with the gap and the basement membrane.ConclusionsRPMCs could induce inflammation injury stimulated by LPS, further amplifying inflammatory response.

【Key words】Peritoneal adhere; Peritoneal mesothelial cell;IL-1β;IL-6; Lipopolysacchride

〔中图分类号〕R641

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)07-1560-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.011

通讯作者：颜帅(1986-)，男，博士，主治中医师，主要从事中医药防治术后创面修复及结肠动力研究。

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81373843)

1苏州市中医医院

第一作者：曾莉(1962-),女,博士,教授,博士生导师,主要从事中医药防治术后腹腔粘连研究。