褪黑素对糖尿病大鼠视网膜中糖基化终产物及其受体表达的影响

杨笑天　张建华　杨笑宇　王柏欣　王显钢　孟德欣　李　晶

(佳木斯大学附属第一医院眼科，黑龙江　佳木斯　154002)



褪黑素对糖尿病大鼠视网膜中糖基化终产物及其受体表达的影响

杨笑天张建华1杨笑宇2王柏欣1王显钢1孟德欣1李晶1

(佳木斯大学附属第一医院眼科，黑龙江佳木斯154002)

〔摘要〕目的研究褪黑素(MT)对糖尿病大鼠视网膜中糖基化终产物(AGE)和其受体(RAGE)表达的影响。方法清洁级雄性Wistar大鼠80只，体重180~200 g，随机分为正常对照组、模型对照组、低剂量MT组和高剂量MT组。模型对照组、低剂量MT组和高剂量MT组给予高脂高糖饮食配合链尿佐菌素腹腔注射诱导糖尿病模型。造模成功后，低剂量(10 mg·kg(-1)体重·d(-1))和高剂量(20 mg·kg(-1)体重·d(-1))MT灌胃16 w。HE染色观察大鼠视网膜病理学改变，免疫组化(SABC)法检测各组大鼠视网膜中AGE和RAGE表达的变化。结果16 w后，HE染色观察，低剂量和高剂量MT组视网膜病理改变程度均较模型对照组轻。与模型对照组比较，免疫组化法检测低剂量和高剂量MT组AGE和RAGE蛋白阳性表达量明显降低(P<0.05)。结论MT可改善糖尿病大鼠视网膜形态变化，并可下调AGE和RAGE在糖尿病大鼠视网膜中的表达。

〔关键词〕糖尿病视网膜病变；褪黑素；糖基化终产物；糖基化终产物受体

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病主要的并发症之一，随病情的进展，患者出现不可逆的视力下降，甚至失明。DR的发病机制复杂，糖基化终产物(AGE)及其受体(RAGE)在DR发生发展中起着重要的作用〔1~3〕。褪黑素(MT)是松果体分泌的一种重要激素，具有调节睡眠、生殖及昼夜节律等生理功能。研究发现，MT具有很强的抗氧化活性，并作为高选择性电子供体，参与体内多种生化反应〔4〕。本实验观察MT对糖尿病大鼠视网膜中AGE和RAGE表达的影响及保护机制。

1材料与方法

1.1材料清洁级雄性Wistar大鼠80只，体重180~200 g(长春亿斯实验动物技术有限责任公司)；链尿佐菌素(STZ，美国Sigma公司)；MT，浙江黄岩延年褪黑素有限公司；RAGE单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；AGE多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒和浓缩型二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)

1.2模型的建立和分组大鼠适应性喂养1w后，随机分为正常对照组、模型对照组、低剂量MT组和高剂量MT组，每组20只。模型对照组、低剂量MT组和高剂量MT在给予高脂高糖饮食4 w后，禁食24 h，按50 mg·kg-1·体重·d-1腹腔注射STZ，正常对照组注射等体积柠檬酸缓冲液。给药后72 h，以空腹血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。造模后，每天10∶00至14∶00灌胃一次，低剂量MT组灌胃剂量为10 mg·kg-1体重·d-1，高剂量MT组灌胃剂量为20 mg·kg-1体重·d-1，正常对照组和模型对照组用等体积生理盐水灌胃，持续16 w。

1.3HE染色和免疫组化染色实验结束时，无菌手术取出完整眼球置入4%多聚甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，4 μm连续矢状切片。HE染色观察视网膜病理改变。超敏二步法检测AGE(一抗1∶100，4℃过夜)和RAGE(一抗1∶50，4℃过夜)表达改变。应用Image-ProPlus 6.0图像分析系统计算AGE和RAGE的阳性染色平均灰度值。

1.4统计学处理应用SPSS16.0统计软件进行方差分析。

2结果

2.1各组视网膜HE染色正常对照组视网膜HE染色切片可见，视网膜各层结构清晰，排列整齐。模型对照组视网膜各层排列紊乱，节细胞缺失，神经纤维层变薄，颗粒细胞排列紊乱，网状结构疏松。低剂量MT组和高剂量MT组视网膜各层结构较清晰，排列较整齐，节细胞缺失少见，颗粒细胞排列较规整。见图1。

图1　各组视网膜HE染色(×200)

2.2各组视网膜AGE、RAGE含量变化AGE阳性表达见于视网膜各层内，棕黄色阳性表达物质无特殊表达部位。RAGE阳性表达主要见于节细胞层和神经纤维层，棕黄色阳性表达物质多见于细胞膜。与正常对照组比较，模型对照组、低剂量MT组和高剂量MT组AGE、RAGE表达含量显著升高(P<0.05)；与模型对照组比较，低剂量MT组和高剂量AGE、RAGE阳性表达明显降低(P<0.05)。见表1，图2和图3。

表1　各组视网膜中AGE和RAGE阳性

与正常对照组比较：1)P<0.05；与模型对照组比较：2)P<0.05

图2　各组视网膜AGE免疫组化染色(×400)

图3　各组视网膜RAGE免疫组化染色(×400)

3讨论

DR病理表现为视网膜毛细血管周细胞功能障碍，甚至凋亡，毛细血管基底膜增生、微血管闭塞和无灌注微区出现，动脉瘤生成、眼底出血和渗出，增殖期表现为黄斑水肿和新生血管形成，纤维血管增殖及收缩牵拉，导致视网膜脱离〔5〕。正常人体的各种组织中有少量AGE形成，且其形成水平随年龄增长可缓慢增加；对于糖尿病患者，在高血糖状态下AGE的形成可被加速。氧化应激参与AGE的形成，且形成的AGE可使超氧自由基转变成为活性更高的羟自由基，从而使机体内的氧化应激进一步增强。RAGE是AGE介导其病理损伤反应的信号转导受体。AGE-RAGE相互作用可激活多个信号转导途径，引起氧化应激及相关细胞因子的合成，导致氧化损伤和炎症反应，从而促进DR发展〔6，7〕。MT因其具有极强的抗氧化性，可直接清除细胞内氧自由基，可抑制氧化应激反应，从而可能进一步影响AGE的形成及其与RAGE的联合作用。本实验证实MT对糖尿病大鼠非酶糖基化过程具有抑制作用。

4参考文献

1Fried LF，Emanuele N，Zhang JH，etal.Combined angiotensin inhibition for the treatment of diabetic nephropathy〔J〕.N Engl J Med，2013;369(20)：1892-903.

2陈百华，姜德咏，唐罗生.糖基化终产物对牛视网膜毛细血管周细胞内抗氧化能力的影响〔J〕.中华眼底病杂志，2002;18(2)：143-5.

3Curtis TM，Hamilton R，Yong PH，etal.Müller glial dysfunction during diabetic retinopathy in rats is linked to accumulation of advanced glycation end-products and advanced lipoxidation end-products〔J〕.Diabetologia，2011;54(3)：690-8.

4Tan DX，Chen LD，Poeggeler B，etal.Melatonin:a potent，endogenous hydroxyl radical scavenger〔J〕.Endocrinol J，1993;1(1)：57-60.

5Chen M，Curtis TM，Stitt AW.Advanced glycation end products and diabetic retinopathy〔J〕.Curr Med Chem，2013;20(26)：3234-40.

6Yamagishi S，Amano S，Inagaki Y，etal.Advanced glycation end products-induced apoptosis and over expression of vascular endothelial growth factor in bovine retinal pericytes〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2002;290(3)：973-8.

7Caldwell RB，Bartoli M，Behzadian MA，etal.Vascular endothelial growth factor and diabetic retinopathy:pathophysiological mechanisms and treatment perspectives〔J〕.Diabetes Metab Res Rev，2003;19(6)：442-55.

〔2014-12-19修回〕

(编辑杜娟)

〔中图分类号〕R589.1

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)07-1580-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.019

通讯作者：孟德欣(1973-)，男，医学博士，副教授，主要从事糖尿病及其并发症的发病机制研究。

基金项目：黑龙江省自然科学基金(D201046)；佳木斯大学人才培养项目(RC2010-018)

1佳木斯大学基础医学院2佳木斯大学附属第二医院

第一作者：杨笑天(1973-)，女，医学硕士，副主任医师，主要从事糖尿病眼病的研究。