姜黄提取物对畜禽病原菌的抑制作用

周云晓，董玲燕，赵丽娟，方　明，王进波*

（1.浙江大学宁波理工学院，浙江宁波　315100；2.宁波中药制药有限公司，浙江宁波　315806）



姜黄提取物对畜禽病原菌的抑制作用

周云晓1，董玲燕2，赵丽娟2，方明2，王进波1*

（1.浙江大学宁波理工学院，浙江宁波315100；2.宁波中药制药有限公司，浙江宁波315806）

摘要：采用水蒸气蒸馏法和索氏提取法提取姜黄挥发油，采用80％乙醇浸提、结晶法制备姜黄素。利用滤纸片固相扩散法研究了3种姜黄提取物对6种畜禽病原菌的抑菌活性；利用平板涂布法研究了姜黄提取物对6种病原菌的的最低抑菌浓度。结果表明，两种姜黄挥发油和姜黄素对畜禽病原菌具有一定抑菌活性，姜黄挥发油的抑菌效果好于姜黄素，其中水蒸汽蒸馏法提取的姜黄挥发油抑菌效果最佳。3种提取物对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门菌、猪伤寒沙门菌、猪链球菌和志贺氏菌的最低抑菌浓度分别为：水蒸汽蒸馏姜黄挥发油6.25、6.25、12.5、6.25、12.5、6.25 mg·mL(-1)；索氏提取姜黄挥发油12.5、12.5、25.0、12.5、25.0、12.5 mg·mL(-1)；姜黄素50.0、100.0、50.0、25.0、100.0、50.0 mg·mL(-1)。

关键词：姜黄；挥发油；姜黄素；病原菌；抑制作用

姜黄是一种传统中药，能行气破瘀，通经止痛。主治胸腹胀痛，肩臂痹痛，心痛难忍，产后血痛，疮癣初发，月经不调，跌打损伤等。近年来，国内外研究发现，姜黄具有抑制肿瘤、降低血脂、抗菌消炎、护肝利胆和防治神经系统疾病等多种功效[1]。姜黄中研究最广泛、最深入的活性成分是姜黄素，该成分作为治疗许多疾病的药物已进入临床试验阶段，有望开发成为新型药物。近年来，针对姜黄在畜禽饲料中的应用已进行了大量研究，研究表明姜黄素能够促进动物生长，提高动物产品质量，预防和控制疾病的发生，是一种具有广阔前景的饲料添加剂[2-3]。作为姜黄中含量最为丰富的成分，姜黄挥发油与其他植物挥发油相似，是一种由多种成分组成的天然植物精油，具有抗菌、抗氧化、抗应激等多种生物学功能，但其在动物生产中的应用研究较少。本研究利用不同方法提取制备了姜黄挥发油和姜黄素，并比较了这些成分对畜禽主要病原菌的抑制作用。

1　材料与方法

1.1试验材料

致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门菌、猪伤寒沙门菌、猪链球菌、志贺氏菌由实验室保存。

LB培养基：蛋白胨10 g·L-1、酵母浸粉5g·L-1、NaCl 10 g·L-1。固体LB培养基中另加15 g·L-1琼脂粉。上述培养基按常规方法，高压灭菌后，置4℃冰箱保存，备用。

1.2试验方法

1.2.1水蒸汽蒸馏法提取姜黄挥发油

取粉碎至40目的姜黄粉末50 g，置于1 000 mL平底烧瓶中，加入适量的蒸馏水使其润湿，水蒸气蒸馏约4 h，收集水—姜黄挥发油馏出液，将馏出液转移至分液漏斗中，用石油醚（30～60℃）分次萃取，萃取液加入适量的无水硫酸钠低温干燥24 h后过滤，滤液旋转蒸发挥去石油醚，收集挥发油并称重。

1.2.2索氏提取法提取姜黄挥发油

取粉碎至40目的姜黄粉末50 g，用滤纸包成小包放入索氏提取器中，提取瓶内加入石油醚200 mL，然后固定在铁架台上，置于55～60℃恒温水浴锅中，同时冷凝水回流至提取器中液体无色，取出提取液，加无水硫酸钠低温干燥24 h过滤，旋转蒸发挥去滤液中的石油醚，收集挥发油并称重。

1.2.3姜黄素的提取

取粉碎至40目的姜黄粉与80％乙醇以质量体积比1ϑ5～1ϑ10混合均匀，200 r·min-1，提取2 h，过滤并收集滤液，重复提取3次，将3次提取的滤液合并。浓缩至饱和，置于4℃结晶，收集晶体，得纯度≥95％的精制姜黄素。

1.2.4菌体悬液及平板的制备

将供试菌分别从4℃冰箱中取出，接种到新鲜斜面培养基上活化后，用无菌接种环从斜面培养基上分别挑取各供试菌，将细菌接种在LB液体培养基中，37℃、220 r·min-1震荡培养24 h。通过平板计数法，确定菌液的稀释度，使最后的菌悬液含量为107cfu·mL-1，待用。

1.2.5不同姜黄提取物的抑菌效果

用无菌移液枪吸取上述菌悬液200 μL于固体培养基表面上，用无菌涂布棒涂布均匀。用无菌镊子夹取灭菌圆形滤纸片（直径6 mm），分别浸于30.0 mg·mL- 1的姜黄素、姜黄挥发油（索氏提取）、姜黄挥发油（水蒸汽蒸馏）中，20 min后取出、沥干，将上述滤纸片轻轻贴在固体平板上，每个培养皿贴3片，每组做3个平行。姜黄挥发油以1％的吐温-80水溶液作为对照，姜黄素以含有等浓度二甲亚砜的蒸馏水作为对照，同时设置一个无菌滤纸片的培养皿作为空白对照，放入恒温培养箱中，细菌在37℃下培养24 h，用游标卡尺进行测量，并计算抑菌圈直径大小的平均值。

抑菌圈直径大小（含滤纸片直径）在7～9 mm时为低度敏感抑菌作用；在10～15 mm时，为中度敏感抑菌作用；抑菌圈直径大小>15 mm时有高度敏感抑菌作用，无抑菌圈或抑菌圈直径<5 mm为无抑菌作用。

1.2.6姜黄提取物最低抑菌浓度的测定

用吐温-80水溶液（1％）稀释成不同浓度（100.0、50.0、25.0、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 mg·mL-1）的姜黄挥发油稀释液；姜黄素以适量二甲亚砜溶解后，用蒸馏水配制成不同浓度（100.0、50.0、25.0、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 mg·mL-1）的姜黄素溶液。菌悬液与各浓度挥发油的稀释液（或姜黄素溶液）1ϑ1混合均匀成为混合液。取0.2 mL混合液于平板中，涂布均匀，倒置于37℃恒温培养箱中培养24 h。观察菌体生长情况，生长菌体为阳性（+），不生长菌体为阴性（-），以不生长菌体的最低浓度为该成分的最低抑菌浓度（MIC）。姜黄挥发油以1 ％的吐温-80水溶液为对照，姜黄素以含有等浓度二甲亚砜的蒸馏水为对照，每个处理重复3次。

2　结果与分析

2.1不同姜黄提取物的抑菌效果

不同姜黄提取物的抑菌效果见表1。

表1　不同姜黄提取物的抑菌效果　mm

本研究利用滤纸片法，分析了30.0 mg·mL-1不同姜黄提取物对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门菌、猪伤寒沙门菌、猪链球菌、志贺氏菌等畜禽致病菌的抑菌效果，结果表明，姜黄挥发油对供试菌的抑菌效果明显好于姜黄素，而且水蒸汽蒸馏提取的姜黄挥发油的抑菌效果明显好于索氏提取的姜黄挥发油。致病性大肠杆菌对两种姜黄挥发油均高度敏感，猪伤寒沙门氏菌和志贺氏菌对水蒸汽蒸馏法提取的姜黄挥发油也高度敏感；其余菌株对两种姜黄挥发油均为中度敏感。致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门菌、猪伤寒沙门菌、和志贺氏菌对姜黄素低度敏感，而金黄色葡萄球菌、猪链球菌则对姜黄素不敏感。

2.2水蒸汽蒸馏提取的姜黄挥发油对各种供试菌的最低抑菌浓度

水蒸汽蒸馏提取的姜黄挥发油对供试菌的MIC见表2。

由表2可知，水蒸汽蒸馏法提取的姜黄挥发油对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门菌、猪伤寒沙门菌、猪链球菌和志贺氏菌的MIC存在差异，其中致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门菌和志贺氏菌的MIC值较低，对鸡白痢沙门菌和猪链球菌MIC值则较高。

2.3索氏提取的姜黄挥发油对各种供试菌的最低抑菌浓度

索氏提取的姜黄挥发油对供试菌的MIC见表3。

由表3可知，索氏提取的姜黄挥发油对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门菌和志贺氏菌的MIC值较低；对鸡白痢沙门氏菌和猪链球菌的MIC值较高。由表2、3可知，索氏提取的姜黄挥发油比水蒸气蒸馏法提取的姜黄挥发油的抗菌能力低。

2.4姜黄素对各种供试菌的最低抑菌浓度

姜黄素对供试菌的MIC见表4。

表2　水蒸汽蒸馏提取的姜黄挥发油对供试菌的最低抑菌浓度

表3　索氏提取的姜黄挥发油对供试菌的最低抑菌浓度

表4　姜黄素对供试菌的MIC

由表4可知，姜黄素对畜禽病原菌的MIC明显高于姜黄挥发油，说明姜黄素的抑菌效果明显比姜黄挥发油差。

3　讨论

本研究比较了不同姜黄提取物对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门菌、猪伤寒沙门菌、猪链球菌和志贺氏菌等畜禽病原菌的抑制作用，结果表明，水蒸汽蒸馏法提取的姜黄挥发油抑菌效果最好，索氏提取法提取的姜黄挥发油的抑菌效果次之，姜黄素的抑菌效果最差。

不同研究者对姜黄提取物的抗菌活性进行探索，结果表明，姜黄挥发油和姜黄素对细菌、真菌、酵母菌等多种微生物均具有抑制作用。杜青云等研究姜黄挥发油对红色毛癣菌等真菌的抑制作用，结果表明，姜黄挥发油对引起人类皮肤癣菌病的真菌具有极强的抑菌作用[4]。胡小军等研究发现，石油醚提取的姜黄挥发油能够抑制金黄色葡萄球菌、黑曲霉阳性菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的生长[5]。齐莉莉等对姜黄提取物抑菌作用的研究表明，姜黄挥发油能够显著抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和青霉菌的生长[6]。李晓鹏研究证明，姜黄素和姜黄挥发油对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、白地霉均有抑制作用[7]。夏承来等测定姜黄素对淋球菌的抑制作用，结果发现姜黄素对淋球菌有明显抑菌效果，其最小抑菌浓度是100 mg·mL-1[8]。本研究分析姜黄提取物对主要畜禽致病菌抑制作用，结果与上述研究结论一致，姜黄挥发油和姜黄素均具有较好抗菌效果。

本研究比较水蒸汽蒸馏提取的姜黄挥发油、索氏提取姜黄挥发油和姜黄素抑菌效果差异，测定3种提取物的MIC。结果表明，水蒸汽蒸馏提取的姜黄挥发油抑菌效率最高，索氏提取的姜黄挥发油次之，姜黄素的抑菌效率最低。姜黄挥发油与一般植物挥发油类似，其化学组成成分主要以萜类化合物为主，含有姜油烯、龙脑（2-莰醇）、水芹烯、姜黄酮、姜黄素等多种化学成分，这些化学成分均具有抑菌效果，其多种成分的组合就具有很强的抑菌作用。而姜黄素是1种二酮类化合物，其具有一定抗菌效果，仅为1种成分，故其抗菌能力没有姜黄挥发油高。与水蒸汽蒸馏法获得的姜黄挥发油相比，索氏提取的姜黄挥发油中脂溶性色素等成分的含量较高，这些色素没有抗菌活性，因此，索氏提取的姜黄挥发油抗菌效率低于水蒸汽蒸馏提取的姜黄挥发油。

[参考文献]

[1]Prasad S,Gupta S C,Tyagi A K,et al.Curcumin,a component of golden spice:from bedside to bench and back[J].Biotechnology Advances,2014,32（6）:1 053-1 064.

[2]赵春萍.姜黄素对大肠杆菌攻毒仔猪生长性能及肠粘膜屏障功能的影响[D].海口:海南大学,2015.

[3]周明,张靖,申书婷,等.姜黄素在育肥猪中应用效果的研究[J].中国粮油学报,2014,29（3）:67-73.

[4]杜青云,王国胜,张铭穷.中药姜黄挥发油体外抗真菌实验研究[J].中国皮肤性病学杂志,1997,11（4）:212,230.

[5]胡小军,李凤侠.姜黄油抑菌作用的研究[J].食品研究与开发,2006,127（5）:30-31.

[6]齐莉莉,王进波.姜黄提取物的抗氧化及抗菌活性研究[J].中国调味品,2008（2）:72-73,83.

[7]李晓鹏.姜黄素的提取、分离及抑菌、抗肿瘤活性研究[D].济南:山东师范大学,2010.

[8]夏承来,黄汉辉,何之广.姜黄素体外抑制淋球菌活性的研究[J].中国医药科学,2014,2（8）:21-22,25.

Antimicrobial Activities of the Extracts from Curcumalonga on Livestock and Poultry Pathogenic Bacteria

ZHOU Yunxiao1,DONG Lingyan2,ZHAO Lijuan2,FANG Ming2,WANG Jinbo1*
（1.Ningbo Institute of Technology,Zhejiang University,Ningbo 315100,Zhejiang China; 2.Ningbo Traditional Chinese Pharmaceutical Co.,Ltd.,Ningbo 315806,Zhejiang China）

Abstract:The volatile oil was extracted from Curcuma longa by water steam distillation and Soxhlet method.Curcumin was extracted with 80％ ethanol.The antimicrobial activities of three turmeric extracts were determined by plate diffuse to six pathogenic bacteria.The minimum inhibitory concentration of the extracts was investigated by plate spread.The results indicated that all the 3 kinds of extracts showed antibacterial activity.Compared with the antimicrobial activity of curcumin,the volatile oils showed stronger antimicrobial activity.The minimum inhibitory concentration of Escherichia coli O157,Staphylocous aureus,Salmonella pullorum,Salmonella typhisuis,Streptococ⁃cus suis and Shigella Castellani was as followed.The volatile oil extracted by water steam distillation was 6.25,6.25,12.5,6.25,12.5 and 6.25 mg·mL(-1); the volatile oil extracted by Soxhlet method was 12.5,12.5,25.0,12.5,25.0 and 12.5 mg·mL(-1); curcumin was 50.0,100.0,50.0,25.0,100.0 and 50.0 mg·mL(-1).

Key words:Curcuma longa; volatile oil; curcumin; pathogenic bacteria; antimicrobial activities

*通讯作者：E-mail:178283261@qq.com。

作者简介：周云晓（1994-），女，浙江绍兴人，硕士研究生，研究方向为天然产物提取及功能。

基金项目：宁波市重大科技攻关项目（2014B11005；2013C11031）

收稿日期：2016-01-23

中图分类号：R286；S852.61

文献标志码：A

文章编号：1001-0084（2016）03-0044-04