黄瓜籽蛋白提取工艺及性质研究

陈丽艳，王天龙，王　萍，王伟明

(黑龙江省中医药科学院中药所，哈尔滨 150036)



·方药研究·

黄瓜籽蛋白提取工艺及性质研究

陈丽艳，王天龙，王萍，王伟明*

(黑龙江省中医药科学院中药所，哈尔滨 150036)

摘要：目的确定黄瓜籽蛋白最佳提取工艺，并对蛋白等电点及分子量进行考察。方法采用盐溶法通过L9(34)正交试验进行提取工艺考察，通过测定最低溶解度的pH值确定蛋白等电点、硫酸铵分级沉淀及膜透析除盐得到黄瓜籽蛋白，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白分子量。结果黄瓜籽蛋白最佳提取工艺为NaCl溶液浓度0.14 mol/L、料液比1∶3、提取温度4 ℃、pH值5、浸提时间8 h、提取次数为3 次，经计算生药黄瓜籽中蛋白含量为3.04%，硫酸铵沉淀饱和度为55%，等电点为3.8，蛋白分子量分布于35 KD以下。结论本法确定了黄瓜籽蛋白的最佳提取工艺及性质，为蛋白的进一步分离、纯化及活性研究奠定了基础。

关键词：黄瓜籽；蛋白质；提取工艺；等电点；分子量

黄瓜籽为葫芦科植物黄瓜(CucumbersativusL.)的干燥成熟种子。《中华本草》中记载其具有续筋接骨、祛风、消痰的功效，主治骨折筋伤、风湿痹痛、老年痰喘[1]。黄瓜籽中含有皂苷、氨基酸、糖类、植物甾醇、三萜类、挥发油等化学成分[2]，而对其蛋白质的研究尚不足。植物种子一般含有丰富的蛋白质，且具有广泛的生物活性，如大豆蛋白、南瓜籽蛋白等对人体多种疾病有预防和治疗作用[3-4]。从植物中提取蛋白质的方法有多种，其中盐溶法有利于保持蛋白的活性和稳定性[5-6]。本研究利用盐溶法提取黄瓜籽蛋白，通过正交试验确定最佳提取工艺，并测定蛋白等电点、分析硫酸铵分级沉淀饱和度，并通过SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白分子量分布，为黄瓜籽蛋白进一步分离、纯化及活性研究奠定基础。

1材料

1.1仪器UV-2550 型紫外可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)；KE.WEI 型电热恒温水浴锅(北京科伟永新实验仪器设备厂)；AF-20A型密封型摇摆式中药粉碎机(温岭市奥利中药机械有限公司)；98-1-C型数字控温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；SHB-IIIA型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；YP2001N型、YP20KN型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；透析袋 3.5 KD截留量 27 mm(美国)；X85-2恒温磁力搅拌器(上海梅颖浦)；DYY-12型电泳仪(北京市六一仪器厂)；BCD-225SLDA智能控温电冰箱(海尔)。

1.2试药黄瓜籽购于安国市奉义中药饮片有限公司，经黑龙江省中医药科学院王伟明教授鉴定为葫芦科甜瓜属植物黄瓜(CucumissativusL.)的干燥成熟种子，使用前烘干并粉碎成粗粉。

2方法

2.1黄瓜籽脱脂粉的制备黄瓜籽粗粉按料液比1∶3(M/V)加入石油醚(60～90 ℃)搅拌后于4 ℃浸提12 h,滤过，回收石油醚，药渣通风干燥即得黄瓜籽脱脂粉,100 g黄瓜籽脱脂后得到73.4 g脱脂粉。

2.2黄瓜籽蛋白提取工艺研究采用L9(34)正交实验法，以相同质量脱脂黄瓜籽粉的蛋白含量为指标进行考察。为了保持蛋白活性，采用4 ℃低温提取，前期通过单因素考察得到Nacl浓度为0.14 mol/L、料液比1∶3较适宜，因此本研究仅对影响蛋白提取的关键因素pH值、浸提次数和浸提时间3个因素进行考察[7]，因素水平设置如表1。

表1　正交试验因素水平表

2.3黄瓜籽蛋白的含量测定采用Bradford法[8](考马斯亮蓝可溶性蛋白微量测定法)进行测定。

2.3.1标准蛋白质溶液的制备精密称取牛血清蛋白(BSA)10 mg，加生理盐水定容至10 mL，配成1.0 g/L的标准蛋白质溶液。

2.3.2考马斯亮蓝G-250的配制[9]称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 90%乙醇中，加入85%的磷酸溶液100 mL，用蒸馏水定容至1L,溶解后过滤，保存至棕色瓶内。

2.3.3蛋白含量标准曲线绘制取7个试管，按顺序分别加入0、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 mL的标准蛋白质溶液，每个试管补充蒸馏水至0.2 mL，每管各加入G-250溶液10 mL，摇匀，于595 nm处测定吸光度值,实验重复3次。以标准蛋白含量(mg)为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线,得到蛋白质含量标准曲线为Y=3.441 4X+0.008 4(r=0.991 6)，表明蛋白质在0.02～0.2 g/L呈良好线性关系。

2.3.4样品的测定取样品溶液0.2 mL同法测定吸光度值，根据标准曲线计算蛋白含量。

2.4蛋白等电点(pI)的测定[10]蛋白在一定溶剂中溶解度最低时的pH值即为蛋白等电点。按表4向每个试管内精密加入相应试剂，混匀，静置20 min，观察每支试管内溶液的混浊度，以-、+、++、+++、++++符号表示沉淀的多少确定蛋白的pI。

2.5硫酸铵分级沉淀黄瓜籽蛋白[11]

2.5.1硫酸铵分级盐析方法 称取50 g脱脂黄瓜籽粉,根据正交试验确定的最优提取工艺进行提取，得到蛋白提取液，准确量取50 mL，用6 mol/L HCl溶液调节溶液的pH至pI。进行盐析时，先将硫酸铵磨成粉末，按照所需饱和度的要求，边搅拌边缓慢加入硫酸铵达到一定饱和度(30%、45%、55%、65%、75%、90%)。整个盐析过程中保持在4 ℃。盐析后放置1 h，待沉淀完全后离心过滤，将各段沉淀分别用0.14 mol/L NaCl溶液复溶至25 mL，同法测定各段沉淀的蛋白含量。

2.5.2蛋白质的脱盐[12]将硫酸铵沉淀得到的蛋白质溶液装入截留分子量为3.5 KD的透析袋，置于水中透析除盐，经常换水，并以10% BaCl2溶液检测脱盐是否彻底。为了防止微生物污染和蛋白质变性，透析应在低温环境下(4 ℃)进行。

2.6黄瓜籽蛋白分子量分布[13]采用SDS-PAGE凝胶电泳与标准蛋白对比评估黄瓜籽蛋白的分子量分布。

3结果

3.1正交试验结果正交试验结果、方差分析见表2和表3，由极差分析和方差分析可知，3个因素对蛋白提取率的影响顺序为B>A>C，其中B因素影响最显著(P<0.05)。最终确定黄瓜籽蛋白最佳提取工艺为A1B3C3，即pH值为5，浸提次数为3次，浸提时间8 h，提取的蛋白含量最高，经验证该工艺得到脱脂黄瓜籽粉蛋白含量为4.14%，折算成生药量蛋白含量为3.04%。

表2　黄瓜籽蛋白提取工艺正交试验结果

表3　正交设计方差分析

3.2蛋白等电点测定结果蛋白等电点结果显示，当pH=5.6时，溶液开始出现浑浊，pH=3.8时沉淀最多，随着pH降低沉淀减少，可初步确定黄瓜籽蛋白的等电点为3.8。见表4。

3.3硫酸铵分级沉淀结果硫酸铵饱和度为30%时黄瓜籽蛋白开始析出，当饱和度达到55%时生成的沉淀蛋白含量最高。由结果可知,当硫酸铵饱和度达到55%～65%时,蛋白析出可达到50%以上。

3.4SDS-PAGE结果经Quantity one软件分析,黄瓜籽蛋白分子量在35 KD以下,其中分子量在14.4 KD以下的蛋白分布较密集。

表4　蛋白等电点测定结果

4讨论

黄瓜籽功效及安全性被人们普遍认可并广泛应用于骨折后愈合及骨质疏松的预防和辅助治疗。一些学者[2,14-16]针对黄瓜籽化学成分、功能评价及药理作用等进行了相应的研究，但对其蛋白类成分的研究尚不充分。蛋白质是一类重要的高分子化合物，其复杂的结构导致物理和化学性质的不稳定，因此在提取过程中要综合考虑各因素的影响。为了保持蛋白活性采用低温浸提的方法，通过正交试验得到了黄瓜籽蛋白最佳提取工艺，其中浸提次数对蛋白提取影响最显著，提取次数过少，蛋白不能充分溶解释放到溶剂中致使蛋白含量较低；pH值是影响蛋白质提取及保持活性的一个重要因素，在中性偏酸性条件下更利于保持蛋白质的生物活性；浸提时间过短蛋白提取不充分，时间过长易导致蛋白分解，经实验验证8 h最适宜。确定了黄瓜籽蛋白的等电点及硫酸铵分级沉淀的适宜饱和度，为蛋白的精制奠定基础。一般来说，蛋白质在不同pH条件下溶解度不同，只有当溶液pH接近等电点时，大部分蛋白才能为饱和硫酸铵沉淀出来，因此盐析时常选择溶液pH值在该蛋白质等电点附近。通过SDS-PAGE凝胶电泳确定了黄瓜籽蛋白分子量为小分子蛋白，据报道[17]，小分子蛋白通常具有较好的生物活性，更利于人体的吸收和利用。蔡伟明等[18]研究了黄瓜籽多肽的抗骨质疏松作用，证实了黄瓜籽小分子蛋白的活性，然而对多肽或蛋白的提取工艺及分子量尚未提及，本实验确定了黄瓜籽蛋白的最优提取工艺及性质，为黄瓜籽蛋白进一步分离纯化及相应的活性研究奠定了基础。

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Extraction technology and characteristics of seed protein of Cucumber sativus L.

CHEN Liyan,WANG Tianlong,WANG Ping,WANG Weiming*

(Heilongjiang Traditional Medical Academy of Sciences,Harbin 150036,China)

Abstract：ObjectiveDtermine the optimal extraction technology,isoelectric point and molecular weight of cucumber seed protein.MethodsThe cucumber seed protein was extracted by salt-dissolution and L9(34)orthogonal test was used to determine the optimal extraction technology,pH at lowest solubility of protein was isoelectric point,Ammonium sulfate precipitate and Membrane dialysis were applied to obtain crude protein,and molecular weight of the protein was detected by polyacrylamide gel electrophoresis.ResultsThe optimal extraction technology of cucumber seed protein was:The concentration of sodium chloride was 0.14 mol/L,the ratio of solid and liquid was 1:3,the extraction temperature was 4 ℃,the pH value was 5,the extraction time was 8 h,the extraction times were three times,the protein content was 3.04%.SDS-PAGE result showed that the molecular weight of crude protein was under 35 KD.ConclusionThis experiment determined the best extraction technology and characteristics of cucumber seed protein,and laid the foundation for the further purification and activity research of it.

Keywords：cucumber seed;protein;extraction technology;isoelectric point;molecular weight

(收稿日期:2015-06-30)

文章编号：2095-6258(2016)02-0253-04

中图分类号：R284.2

文献标志码：A

*通信作者：王伟明，博士，研究员，电话-(0451)55665478,电子信箱-1442540238@qq.com

作者简介：陈丽艳(1971-)，女，硕士，副研究员，主要从事中药新药及保健食品的研究与开发。

基金项目：黑龙江省科技攻关项目(GA12C102)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.011