甘蔗宿根矮化病病原菌一推测膜蛋白基因（Lxx18460）单克隆抗体的制备和检测

邵敏　张小秋　张琨琨　杨丽涛　李杨瑞

摘要：【目的】对甘蔗宿根矮化病病原菌（Leifsonia xyli subsp. xyli， Lxx）一推测为抗K因子的膜蛋白基因（Lxx18460）进行研究，为今后研究该基因在感病甘蔗体内表达打下基础。【方法】诱导表达并纯化含有推测为抗K因子的膜蛋白Lxx18460基因的pET-30a质粒菌液，委托南京金斯瑞生物科技有限公司制备单克隆抗体；用Western blotting对细菌及感病和健康甘蔗样品总蛋白进行检测。【结果】Lxx18460基因具有特异性，只存在于甘蔗Lxx中。ELISA单克隆抗体效价大于 1∶512000，能够灵敏地检测细菌总蛋白和甘蔗样品蛋白。Western blotting检测结果表明，Lxx18460基因在细菌中和感病甘蔗样品中表达，在健康甘蔗样品中几乎不表达。【结论】Lxx18460基因具有特异性，是Lxx中的抗K因子的膜蛋白基因，能够在细菌和感病甘蔗样品体外进行表达。

关键词： 甘蔗宿根矮化病；Lxx18460基因；单克隆抗体；ELISA检测；Western blotting检测

中图分类号： Q-331 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）03-0382-07

0 引言

【研究意义】甘蔗宿根矮化病（Ratoon stunting disease， RSD）是普遍存在于植蔗地区的一种世界性重要病害（马丁等，1982；黄应昆和李文凤，2002），其病原为棒状杆菌属Leifsonia xyli subsp. xyli（Lxx） （Davis et al.，1980），寄生于蔗株的维管束中，受害甘蔗发育慢，植株矮小，严重影响甘蔗产量和品质，且该病原细菌特别细小，分离、培养和检测都极其困难。 因子是细菌RNA聚合酶全酶（α2ββ ）的一个蛋白质亚基，它可以识别目的基因启动子区域，促进该区域与RNA聚合酶全酶的结合（Chan et al.，2008），而抗 因子能通过影响 因子的作用抑制转录。因此，对Lxx中抗 因子进行研究，对于防治RSD具有重要意义。【前人研究进展】AsiA是大肠杆菌σ70 RNA聚合酶基因转录的一种抑制子，亦即抗 因子，Urbauer等（2002）通过将AsiA亚克隆进pET-24b表达载体并转化进大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达，其大小约10 kD，进一步分析表明该蛋白以二聚体的形式存在，是一种新型的螺旋折叠结构，它的表达会导致宿主基因转录关闭。RseA是大肠杆菌中跨膜的抗 因子，Campbell等（2003）采用PCR扩增目的片段DNA，构建σE和RseA的表达载体，转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达并进行共纯化，结果表明，RseA能够与 E结合，从而抑制转录。周丹（2012）克隆了Lxx中推测为抗 K因子的膜蛋白Lxx18460基因去跨膜区域的基因可读框349～717序列（385 bp），将该基因克隆至pET-30a表达载体并转化进大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达和纯化，大小为27 kD，并对该基因结构进行了分析，认为该蛋白位于细胞质膜上。Rebecc等（2014）为了研究抗 因子FpvR与 因子PvdS、FpvR的关系，采用TAG标签的串联亲和层析方法对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中的抗 因子FpvR和 因子PvdS进行共纯化，从生理水平证明了抗 因子FpvR与 因子PvdS结合在一起；采用Western blotting对结合在一起的抗 因子FpvR与 因子PvdS进行检测，结果能检测出目的条带，大小为15 kD，但使用FpvI的多克隆抗体未能检测到FpvI，到目前也未发现合适的单克隆抗体；通过构建含有多克隆位点的载体，测定相关β-半乳糖苷酶的活性，证明FpvR的胞质区会对FpvI和PvdS产生抑制。【本研究切入点】目前，有关Lxx中推测为抗 K因子的膜蛋白Lxx18460基因单克隆抗体的制备和检测未见报道，该基因在细菌及甘蔗体外的表达情况尚不清楚。【拟解决的关键问题】采用PCR检测和Western blotting对Lxx18460基因进行研究，旨在了解该基因的特异性、是否存在于细菌体内以及在细菌和感病甘蔗样品体外的表达情况，为今后研究该基因在感病甘蔗体内的表达打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

感病甘蔗和健康甘蔗材料均采自广西大学农学院试验基地，Lxx细菌总蛋白、含有推测为抗 K因子的膜蛋白Lxx18460基因的pET-30a质粒菌液由广西甘蔗遗传改良重点实验室保存。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 抗原制备与纯化 利用IPTG（0.1 mmol/L）诱导表达推测为抗 K因子的Lxx18460基因的pET-30a质粒菌液，收集诱导蛋白表达后的菌液100.0 mL左右，分装在50.0 mL的离心管中，置于经4 ℃预冷的离心机内，4 ℃下5000 r/min离心20 min，弃尽上清液。用QIAGEN公司的Ni2+-NTA及配制的缓冲液纯化重组蛋白，用变性缓冲液Buffer B（100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Urea，pH 8.0）重悬菌体，按缓冲液体积（mL）∶菌体湿重（g）=5∶1进行超声波破碎，加终浓度为1 mg/mL的溶菌酶。将破胞后的菌液分装到1.5 mL离心管中，4 ℃下12000 r/min离心30 min，用1.5 mL离心管收集上清液，约收集3.0 mL左右。Ni2+-NTA摇匀，每个吸2.0 mL，4 ℃下400 r/min离心5 min，甩掉多余水分。加入Buffer B（4.0 mL左右），4 ℃下4000 r/min离心5 min，重复3次。加入2.0 mL變性缓冲液Buffer B，将2.5 mL破胞后的菌体上清液缓慢加入到Ni2+-NTA柱内，使上清与柱内填料混和均匀，放入摇床摇匀 2 h。取出层析柱，室温静置30 min，打开柱底端封口，收集洗脱液。待液体流尽后，用4.0 mL Buffer B漂洗未结合蛋白，收集洗脱液。用Buffer C（100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Urea， pH 6.3）洗脱，每次0.5 mL，洗2次，收集洗脱液。用Buffer D（100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Urea，pH 5.9）洗脱，每次0.5 mL，洗7次。最后用Buffer E（100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HC，8 mol/L Urea，pH 4.5）洗脱，每次0.5 mL，洗4次，目的蛋白一般会在Buffer E中出现。经SDS-PAGE分析鉴定后，用紫外分光光度法检测获得的纯化蛋白质量浓度，-20 ℃保存备用。

1. 2. 2 样品PCR检测 本研究参考Pan等（1998）报道的Lxx 16S-23S rDNA内部转录间隔区（ITS）设计特异引物（表1），同时根据Lxx18460基因的特异性（周丹，2012）设计引物（表1），引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。根据PCR扩增产物有无DNA的特异扩增条带（438 bp）判断样品是否含有RSD病原菌Lxx。以RSD病原菌Lxx DNA作为阳性对照，水为负对照。

1. 2. 3 抗原透析与浓缩 选择美国即用型透析袋，截留分子量为15000，用去离子水将透析袋浸泡10 min，配透析液N10（1 mol/L Tris，10% NP-40，0.1 mol/L PMSF，glycerol，2 mol/L NaCl，2 mol/L Imidazole）2 L左右，将透析袋剪成8 cm左右长度，一头用夹子夹好，放入水中，检查是否漏水，用玻璃珠撑开袋，将水吸出后加入2.0 mL左右的抗原，用镊子夹出玻璃珠，再用夹子将透析袋的另一头夹好，将透析袋放入装有透析液的大烧杯中，再将大烧杯放在搅拌器上不停搅拌，每隔2 h更换一次透析液，约更换4次。在方形盒底部鋪一定厚度的PEG-2000，将透析完的透析袋放入，再覆盖一定厚度的PEG-2000，置于4 ℃展示柜进行浓缩，约浓缩 4 h。用紫外分光光度法检测获得的浓缩后蛋白质量浓度，即为制备单克隆抗体的免疫抗原。

1. 2. 4 抗血清制备与纯化 委托南京金斯瑞生物科技有限公司制备单克隆抗体。

1. 2. 5 单克隆抗体效价测定 以Lxx18460蛋白为包被抗原，含有His标签的不相关蛋白为阴性对照，未加抗原的磷酸盐缓冲液为空白对照，Lxx18460为免疫原制备的单克隆抗体为第一抗体，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG F（c）（GOAT）为酶标抗体。单克隆抗体第一次稀释1000倍，以后采用2倍等比稀释法。在96孔酶联板上检测单克隆抗体的效价，用BIO-RAD Model 550型酶标仪测定450 nm波长下的OD值，计算S/N=样品OD值/对照OD值，最大稀释S/N≥2.1即为阳性。

1. 2. 6 单克隆抗体Western blotting检测 Lxx18460蛋白跑完SDS-PAGE胶后，拆胶，去掉浓缩胶并用ddH2O冲洗2次。把胶、膜浸泡在Transfer Buffer（25 mmol/L Tris Base，192 mmol/L Glycin，0.037% SDS，20%甲醇）中摇15 min。厚滤纸、薄滤纸在转膜之前用Transfer Buffer稍加浸泡，吸掉多余水后即可使用。自上而下依次摆放 1张厚滤纸、2张薄滤纸、胶、膜、2张薄滤纸、1张厚滤纸，200 mA，40 min。转膜后，用铅笔在膜正面左上角做好标记，夹出膜，放在含有PBS-T的盒里，摇5 min，倒掉，倒入含有5%脱脂奶粉的PBS-T中，置于4 ℃展示柜，摇过夜。倒掉脱脂奶粉，用PBS-T洗4次，每次5 min。用含0.1%脱脂奶粉的PBS-T对一抗进行稀释（材料推荐一抗最终浓度为10 μg/mL），置37 ℃恒温箱孵育2 h。PBS-T洗4次，每次5 min，用含0.5%脱脂牛奶的PBS-T对二抗进行稀释（推荐二抗1∶1000），置37 ℃恒温箱孵育1 h。PBS-T洗4次，每次5 min。ECL显色，两液等体积混匀，吸1 mL均匀滴在膜上，显色1.0 min，拍照保存。

2 结果与分析

2. 1 样品的PCR检测结果

以F1/R1为引物的PCR检测结果（图1）显示，甘蔗样品5、7、8、9含有RSD病原菌Lxx，样品3、4、6不含RSD病原菌Lxx，DX120（克雷伯氏菌）、Escherichia coli（大肠杆菌）、HLB（柑橘黄龙病菌）不含RSD病原菌Lxx。以F2/R2为引物的PCR检测结果显示（图2），甘蔗样品5、7、8、9含有RSD病原菌Lxx，样品3、4、6不含有RSD病原菌Lxx，DX120、E. coli、HLB不含有RSD病原菌Lxx（图2）。检测结果说明Lxx18460基因引物具有特异性，可进一步用于单克隆抗体检测。

2. 2 抗原的纯化和浓缩结果

通过进一步的诱导表达获得带有His Tag标签的融合蛋白，相对分子质量大小约27.0 kD，采用His Tag蛋白纯化试剂盒纯化Lxx18460蛋白，并通过SDS- PAGE电泳分析，获得清晰的蛋白条带（图3）。目的蛋白主要在Buffer E中出现，可以从E中收集目的蛋白用于进一步透析和浓缩（图4）。浓缩后，用紫外分光光度法检测获得的纯化蛋白质量浓度为17.1 μg/μL，进行SDS-PAGE鉴定。从图4可以看出，目的蛋白条带较单一，纯度较高，浓度和纯度均达到制备单克隆抗体的要求，可以用作免疫抗原。

2. 3 单克隆抗体的效价检测结果

将纯化后的Lxx18460蛋白免疫小鼠，获得特异性较好的单克隆抗体。用间接ELISA在96孔酶联板上检测鼠单克隆抗体的效价，结果见表2。由表2可知，将抗血清稀释至256000倍时仍有明显的阳性反应，而阴性对照OD值无明显梯度，表明本研究制备的鼠单克隆抗体的效价大于1∶512000。

2. 4 单克隆抗体的Western blotting检测结果

小鼠腹水中除有抗体外还含有一些复杂的混合物，如大量非抗体杂蛋白等，为了消除对试验干扰的物质，需要对小鼠腹水进行纯化。为了检测所制备单克隆抗体的特异性和免疫学活性，采用Western blotting对制备的Lxx18460蛋白进行鉴定，结果（图5）显示，纯化后的血清抗体与His融合的Lxx18460蛋白具有特异性的结合反应，只有一条主要条带，说明Protein A能较好地去除腹水中的杂蛋白，纯化后的抗体检测不出含有His标签的不相关蛋白，表明该抗体具有特异性，制备的单克隆抗体完全能满足下一步试验的要求。

2. 5 甘蔗茎、叶样品的PCR检测结果

根据Lxx18460基因的特异性设计引物进行PCR检测，以RSD病原菌Lxx DNA作为阳性对照，水为负对照，检测甘蔗茎、叶样品的带病情况，结果见图6。从图6可以看出，3～5、8、10～13为感病甘蔗叶，6、7、9、14、15为健康甘蔗叶，16～24为感病甘蔗茎，25、26为健康甘蔗茎。根据甘蔗带病情况可进一步提取蛋白，用于Western blotting检测。

2. 6 感病和健康甘蔗茎、叶总蛋白及细菌总蛋白SDS-PAGE检测结果

用酚抽提的方法分别提取感病和健康甘蔗茎、叶的总蛋白进行SDS-PAGE鉴定，结果见图7和图8。由图7和图8可以看出，蛋白条带清晰，质量较好，可以进行Western blotting检测。

2. 7 感病和健康甘蔗茎、叶总蛋白及细菌总蛋白Western blotting检测结果

将获得的单克隆抗体稀释后作为一抗，对感病和健康甘蔗茎、叶总蛋白及细菌总蛋白进行Western blotting检测，以Lxx18460蛋白为阳性对照。結果表明，Lxx18460蛋白在细菌中能够表达且表达量较高（图9）。对感病和健康甘蔗叶进行Western blotting检测，结果表明，Lxx18460蛋白在健康甘蔗叶中不表达，在感病甘蔗叶中表达（图10）。对感病和健康甘蔗茎进行Western blotting检测，结果表明，Lxx18460蛋白在健康甘蔗茎中不表达，在感病甘蔗茎中表达（图11）。可见，制备的单克隆抗体具有较好的特异性，能够较灵敏地对材料进行检测。

3 讨论

RSD是一个比较难研究的细菌病害，随着生物学技术的发展，人们开始采用一些技术手段研究该菌的致病机理，并采取一些措施对该病菌进行检测。细菌能根据胞外环境的变化而调节自身，为了适应多变的环境，细菌能在细胞受到伤害之前感受和响应这些变化。因此，细菌需要信号转导系统使其感受胞外环境的变化，从而启动不同基因的表达。在转录水平调节基因表达的常见机制是 因子调节，决定了启动子的识别，而抗 因子与 因子又存在密切的联系，抗 因子能结合在σ因子上影响甚至阻碍一些基因表达（Missiakas and Raina，1998；Bashyam and Hasnain，2004）。周丹（2012）克隆了RSD病原菌Lxx中推测为抗 K因子的Lxx18460基因，分析了基因结构和在感病蔗株体内的表达情况，但未证明该基因是否具有特异性、是否存在于RSD病原菌Lxx中及其体外表达情况。

本研究根据Lxx18460基因的特异性设计引物（周丹，2012），虽然PCR产物大小与Pan等（1998）存在不同，但通过比较分析得出该基因具有特异性。谢晓娜等（2013）分离纯化了RSD的病原菌并制备了RSD的多克隆抗体，为甘蔗宿根矮化病的快速检测提供了必要保证，但在Western blotting检测中，多克隆抗体的特异性较低，产生的非特异性条带更多，不能够明确研究某个致病基因。为了进一步研究Lxx18460基因的表达情况，本研究利用IPTG（0.1 mmol/L）诱导Lxx18460基因的蛋白表达并纯化，委托南京金斯瑞生物科技有限公司制备单克隆抗体，ELISA单克隆抗体效价大于1∶512000，能够检测出目的条带，初步证明该基因诱导表达的蛋白在RSD病原菌Lxx中和感病甘蔗样品体外能够表达。但在检测细菌和甘蔗样品的过程中不可避免也会产生一些杂带，一方面，样品本身在提取的过程中会产生降解，尤其是细菌样品较难培养，需要多次收集细菌蛋白进行保存，操作相对繁琐，蛋白在多次收集和保存的过程中产生降解；另一方面，Western blotting只是初步检测，还不够优化，导致背景较深、杂带较多，在后续试验中有必要进一步优化。由于Lxx18460基因诱导表达的蛋白在细菌及样品体外的具体表达量还不明确，因此在后续研究中有必要设计相关的内参基因进行Western blotting分析，以明确该基因诱导表达的蛋白在细菌及样品体外的具体表达量。目前，关于Lxx18460基因诱导表达的蛋白在感病甘蔗体内的表达情况尚不清楚，需要进一步进行切片观察，并以该抗体为探针，直接作用于处理的感病甘蔗茎、叶等各部分，观察在植物体内的表达情况。

4 结论

Lxx18460基因具有特异性，只存在于感染RSD病原菌Lxx的甘蔗中，初步证明Lxx18460基因是Lxx中的抗 K因子的膜蛋白基因；利用该基因诱导表达的蛋白制备单克隆抗体对细菌总蛋白和甘蔗样品进行检测，能够检测出目的条带，进一步证明Lxx18460基因是Lxx中的抗 K因子的膜蛋白基因，且该基因能够在细菌和感病甘蔗样品体外进行表达。

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（责任编辑 麻小燕）