灰树花交配型鉴定分析

杨军　徐吉　宋一鸣　朱坚

摘要：【目的】鉴定灰树花交配型，为灰树花杂交育种提供理论依据。【方法】灰树花孢子萌发后挑取单孢进行镜检，收集孢子单核体；采用原生质体单核化获得原生质体单核体并通过互配确定标准测交菌株T1和T2；采用标准测交菌株与孢子单核体配对及孢子单核体互配后，进行孢子单核体交配型分类，并利用核遷移试验和OWE-SOJ技术鉴定孢子单核体交配型。【结果】分离鉴定获得71株灰树花孢子单核体菌株，原生质体单核化获得17株原生质体单核体菌株，其中标准测交菌株T1（A1B1）10株、T2（A2B2）7株；鉴定71株孢子单核体分别为T1、T2、T3和T4型，其中T1型28株、T2型35株、T3型 4株、T4型4株；核迁移试验鉴定T1、T2、T3和T4的交配型分别为A1B1、A2B2、A2B1和A1B2，OWE-SOJ鉴定结果分别为A1B1、A2B2、A1B2和A2B1。【结论】灰树花属于四极性交配型系统，其交配型分析应以核迁移试验为准，OWE-SOJ技术不适用于灰树花的交配型分析。

关键词： 灰树花；单核体；OWE-SOJ技术；核迁移试验；交配型

中图分类号： S646.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）03-0412-07

0 引言

【研究意义】灰树花（Grifola frondosa）又名贝叶多孔菌、莲花菇、舞茸（日本）等，分类学上隶属于真菌门、担子菌纲、无褶菌目、多孔菌科、树花菌属，是食、药兼用蕈菌（徐锦堂，1997）。灰树花食味鲜美，富含多种维生素、矿物质及生物活性物质，其多糖具有抗肿瘤、改善免疫系统、抗HIV病毒、调节血糖和血脂及胆固醇水平等作用（李小定等，2003），具有极高的利用价值，市场上对其需求量不断增加。有性生殖对食用菌子实体发育和种群多样性及其杂交育种非常重要，学者对食用菌交配系统及交配行为的研究从未间断，但对灰树花的交配型分析未见报道。因此，鉴定灰树花交配型及其交配型系统，对选育更优良高产的灰树花品种具有重要意义。【前人研究进展】近年来，有关灰树花的研究主要集中在活性成分方面（郭予斌等，2011；王帅和李杰，2014；朱小华等，2014），遗传育种方面的研究较少（徐志祥等，2004；刘振伟和史秀娟等，2005；郭家瑞等，2010）。林芳灿等（2000）、程莉等（2007）、陈裕新等（2012）研究表明，OWE-SOJ技术可应用于香菇、侧耳、灵芝等食、药用菌的交配型分析。针对交配型研究，李安政和林芳灿（2013）认为，除在核迁移发生部位、范围不规则时应注意对交配型结果进行审慎分析和验证外，核迁移试验是交配型因子鉴定中一种便捷而准确的研究手段。有关食用菌交配型的研究结果显示，黑木耳（张红等，2002）、大球盖菇（汪虹和曹晖，2006）、金福菇（傅俊生等，2007）和鸡腿菇（尹清玉和李林辉，2008）等菌类是四极性交配型系统。【本研究切入点】目前，关于灰树花交配型鉴定的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】在借鉴其他食用菌交配型研究的基础上，分离、鉴定灰树花孢子单核体极性，并利用核迁移试验和OWE-SOJ技术准确鉴定其交配型，为灰树花杂交育种提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 菌株 供试菌株库藏编号Gr0001+3源自东北食药用菌研究所的白灰树花，由福建省食用菌种质资源保藏管理中心提供。

1. 1. 2 培养基 PDA培养基（g/L）：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g。原种培养基（质量比）：木屑75.0%（粗∶细=1∶2），麦麸8.0%，玉米粉15.0%，蔗糖1.0%，石膏1.0%，配方水含量65.0%。栽培袋培养基（质量比）：木屑45.0%（粗∶细=1∶3），棉籽壳30.0%，麦麸8.0%，玉米粉15.0%，过磷酸钙1.0%，蔗糖1.0%，配方水含量65.0%。MYG再生培养基：麦芽糖5.0 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖10.0 g，维生素B1 30.0 mg，溶于1.0 L 0.6 mol/mL甘露醇。OWE培养基：5.0%橡树木屑浸汁200.0 mL，琼脂20.0 g，加蒸馏水定容至1.0 L。SOJ培养基：鲜榨橘汁200.0 mL，琼脂20.0 g，加蒸馏水定容至1.0 L。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 灰树花栽培 在23～25 ℃下菌丝走菌满袋后、原基开始形成时移入特定条件菇房出菇。菇房条件：温度16～18 ℃，湿度85%～95%，光照强度200～500 lx，二氧化碳浓度不高于1000 mg/L。形成猪脑状原基时，开袋出菇。

1. 2. 2 孢子单核体分离、鉴定 摘取已成熟的灰树花子实体，用75%酒精喷洒消毒，在超净工作台上用灭菌镊子撕取灰树花菇片置于已灭菌的硫酸纸上，菇片具菌管一面朝下。待弹孢24 h后，自封袋收集硫酸纸密封，4 ℃保存备用。

用移液枪吸取少量无菌水在硫酸纸孢子印处吸打，制成担孢子悬液，经梯度稀释至10-3，每个梯度吸取100 μL担孢子液涂布于抗性培养基上（100 μL氨苄西林/100 mL培养基），25 ℃暗培养。1周后待小菌落陆续出现即在显微镜下挑取新萌发菌丝或大菌落边缘的尖端菌丝，转接到PDA试管斜面培养基上。待菌丝长成一定大小的菌落后镜检，将无锁状联合的菌株保藏备用。

1. 2. 3 原生质体单核化和标准测交菌株确定 转接菌株Gr0001+3的菌丝于液体PDA培养基，25 ℃摇床培养7 d，以0.6 mol/mL甘露醇作渗透压稳定剂，采用2%真菌溶壁酶于pH 5.5和30 ℃下酶解5 h（薛平海等，2004）。获得原生质体后，于MYG再生培养基上涂布再生，25 ℃培养3 d，在显微镜下挑取刚萌发的原生质体并转移至PDA斜面继续培养。镜检观察并选取单核化菌丝（无锁状联合）保藏备用。

任取一株原生质体单核化菌株与余下所有菌株配对，凡能与该菌株配对形成锁状联合的归为一类，记为T1；凡不能与该菌株配对形成锁状联合的归为另一类，记为T2。指定T1的交配型为A1B1，T2的交配型为A2B2，T1、T2即为所需的标准测交菌株。

1. 2. 4 孢子单核体4类交配型確定 分别从T1和T2中任取一株菌株与所有孢子单核体菌株配对，凡能与T1菌株配对形成锁状联合的菌株记为T2，能与T2菌株配对形成锁状联合的菌株记为T1；从与T1、T2配对均不能形成锁状联合的菌株中任取一株，与剩余菌株配对，凡能配对形成锁状联合的菌株记为T3，不能形成锁状联合的菌株记为T4。

1. 2. 5 OWE-SOJ技术应用 利用对峙培养，将4种交配型T1、T2、T3及T4菌株两两对峙接种于OWE培养基上，两接种块间相距约0.5 cm，25 ℃下对峙培养1周。当接种块间菌丝接触后，将两接种块沿配对区垂直方向整条切块，并转接至SOJ培养基上。25 ℃下培养10～15 d观察菌落形态。出现无锁状联合的绒毛状菌落，则为A=B≠反应；出现无锁状联合的栅栏型菌落，则为A≠B=反应。

1. 2. 6 核迁移试验 从4组孢子单核菌株T1、T2、T3及T4中，每组取数个单核体进行核迁移试验。第一次配对按T1×T3、T1×T4、T2×T3和T2×T4组合配对。两配对菌块间相距约2.0 cm，培养至菌丝接触后，在配对块外侧各取一菌块分别与相应单核体进行二次配对。以镜检观察有无锁状联合形成来判断有无核迁移现象发生。凡二次配对产生锁状联合，表明相应的第一次配对有核迁移发生，其交配反应为A=B≠；凡二次配对无锁状联合产生，表明相应的第一次配对无核迁移发生，其交配反应为A≠B=。据此确定T1与T3间交配型关系是A=B≠或A≠B=；同理，可鉴定对应的T1与T4间、T2与T3间、T2与T4间的交配型关系。

2 结果与分析

2. 1 灰树花菌株原生质体单核体鉴定及标准测交菌株T1、T2确定

对供试菌株Gr0001+3的菌丝进行原生质体单核化（图1），在其萌发的不同时间点挑取再生原生质体，共获得再生菌株35株，经镜检确认其中17株为单核体（表1）。将确认的17株单核体相互配对后获得两种交配型菌株，其中10株为T1型（即交配型为A1B1），7株为T2型（即交配型为A2B2）。

2. 2 灰树花标准菌株T3、T4确定及孢子单核体交配型常规分析

收集菌株Gr0001+3的孢子并分离鉴定获得71株单核体（图2）。通过与标准测交菌株T1、T2分别配对发现，其中28株单核体为T1型，35株单核体为T2型，余下8株单核体菌株互配，4株为T3型，4株为T4型。将所有的单核体分为T1、T2、T3和T4 4种类型，其各自所占比例分别为39.4%、49.3%、5.6%和5.6%（表2）。

2. 3 4类孢子单核体菌株交配型的准确鉴定

2. 3. 1 OWE-SOJ技术与交配型的准确鉴定 从4种类型孢子单核体菌株中每组随机取3株[T1（3、12、69），T2（5、24、37），T3（34、48、64），T4（16、56、79）]，通过OWE-SOJ技术进行6种组合配对（T1×T2，T3×T4，T1×T3，T2×T4，T2×T3，T1×T4），并观察分析上述54个配对在SOJ培养基上的反应情况，结果出现3种特征反应（图3）。由表3可知，在6种配对组合中，T1×T2和T3×T4的菌丝反应均为一致的“+”反应，进一步确认T1组与T2组、T3组与T4组均为A≠B≠；T1×T3以“F”反应占多数（8个“F”反应，1个不典型“F-”反应），T2×T4以“F”反应稍占优势（5个“F”反应，4个不典型“F-”反应）；T2×T3以“B”反应占多数（7个“B”反应，2个不典型“B-”反应），T1×T4以“B”反应稍占优势（5个“B”反应，4个不典型“B-”反应）。从反应结果可以看出一种趋势，即T1×T3、T2×T4属于“F”反应；T2×T3和T1×T4属于“B”反应。

因此，在指定T1和T2的交配型分别为A1B1和A2B2的情况下，可推断T3的交配型为A1B2、T4的交配型为A2B1。

2. 3. 2 核迁移试验与交配型的准确鉴定 已指定T1（3、12、69）和T2（5、24、37）的交配型分别为A1B1和A2B2，经核迁移试验，通过216组二次配对，发现第一次配对中T1与T4、T2与T3分别发生了核迁移，而T1与T3、T2与T4均未发生核迁移。若第一次配对有核迁移发生，其交配反应为A=B≠，若无核迁移发生，其交配反应为A≠B=。据此推测T3（34、48、64）、T4（16、56、79）的交配型分别为A2B1和A1B2。

2. 3. 3 交配型的鉴定结果 通过OWE-SOJ技术和核迁移试验，发现两种方法鉴定出的交配型不一致。OWE-SOJ技术鉴定T1、T2、T3及T4的交配型分别为A1B1、A2B2、A1B2和A2B1，而核迁移试验鉴定T1、T2、T3和T4的交配型分别为A1B1、A2B2、A2B1和A1B2。鉴于核迁移试验是常规鉴定方法，OWE-SOJ技术是一种辅助验证手段，因此以核迁移试验结果为准（表4）。

3 讨论

本研究中灰树花亲本型单核体菌株T1和T2的数量占T1、T2、T3和T4 4种类型孢子单核体菌株总数的88.7%，可能与亲本型孢子比非亲本型孢子更易萌发或交配型因子发生了偏分离现象有关，此偏分离现象也存在于香菇（程水明和林范学，2007）和杨柳田头菇（张小雷等，2012）等菇类中。

灰树花菌株Gr0001+3的原生质体再生率较低，其原生质体单核化率仅48.57%，与潘迎捷等（1993）对异宗结合食用菌的研究结果基本相符。林芳灿和朱勤钊（1993）研究指出，原生质体的分离主要取决于细胞的生理状态、裂解酶和渗透稳定剂；潘迎捷等（1993）研究指出，形成双核体、单核体和无核体3种原生质体是造成原生质体再生率较低的主要原因；此外，挑取再生菌落的时机也很重要，一般双核体萌发快于单核体。本研究也获得了相似的结果。

OWE-SOJ技术已成功应用于蜜环菌（Darmonoet and Burdsall，1992）、香菇（林芳灿等，2000）和侧耳（程莉等，2007）等食用菌的交配型鉴定，但本研究利用OWE-SOJ技术鉴定灰树花交配型的结果与核迁移试验鉴定结果不一致，说明OWE-SOJ技术不适用于灰树花的交配型分析。原因可能与平菇、香菇菌落表观形态（均呈绒毛状）及菌落反应稳定而灰树花菌落表观形态（主要呈毡状，绒毛少且绒毛状不明显）易受环境影响、菌落反应不稳定有关。OWE-SOJ技术是否适用于其他类型菌落形态菌类交配型判断有待进一步探讨。

核迁移试验作为鉴定食用菌交配型的一种手段，是从微观水平观察锁状联合并以此来推断交配型，可靠性和稳定性高。Raudaskeski和Kothe（2010）及Heitman等（2013）研究认为，核迁移试验是基于B因子的特定功能，在四极性异宗结合菌中只有A≠B≠或A=B≠，即B因子不相同的菌株配对才会发生核迁移，因此两个交配反应同为不亲和配对，根据二次配对有无锁状联合即是否发生核迁移来区分A=B≠及A≠B=两种类型。鉴于此，本研究利用核迁移试验鉴定T1、T2、T3和T4交配型分别为A1B1、A2B2、A2B1和A1B2。

4 结论

本研究结果表明，灰树花属于四极性交配型系统，其交配型分析应以核迁移试验为准，OWE-SOJ技术不适用于灰树花的交配型分析。

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（責任编辑 思利华）