麦穗鱼在硫酸铜药效评估中的应用

罗福广　黎娅　黄杰　易弋

摘要：【目的】筛选出能够指示硫酸铜药效浓度的水生动物，为促进硫酸铜防病技术在水产养殖中的推广应用提供参考依据。【方法】实验室环境下探讨不同硫酸铜浓度（0.07、0.15、0.30、0.60和1.20 mg/L）治疗人工感染寄生虫鱼类的效果，通过多个急性毒性试验筛选药效浓度区间内敏感的指示生物，并结合实际生产，设计一套合理的生物指示硫酸铜药效的养殖病害防治办法。【结果】0.60 mg/L为实验室环境下硫酸铜治疗多子小瓜虫、车轮虫、斜管虫等寄生虫病的适宜浓度；综合各急性毒性试验结果，筛选出硫酸铜杀虫浓度区间（0.15～1.20 mg/L）内敏感的指示生物是麦穗鱼（Pseudorasbora parva），并建立了一套硫酸铜药效评估体系，即在施药后4 h内投放麦穗鱼进行行为、异常情况观察，可评估硫酸铜药效浓度情况。【结论】麦穗鱼可作为水产养殖中硫酸铜治疗寄生虫病药效浓度的指示生物。

关键词： 麦穗鱼；硫酸铜；药效评估；急性毒性

中图分类号： S965.199 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）03-0494-06

0 引言

【研究意义】硫酸铜是水产养殖中常用的杀虫、除藻、消毒剂，因其药效明显、价格低廉、低毒、施放简易而备受养殖户青睐（陈辉和杨先乐，2003；黄琪琰，2004）。实际生产中，硫酸铜泼洒的浓度一般为0.50～0.70 mg/L（黄琪琰和宋承方，1992；周剑等，2014）。由于硫酸铜易受水体有机物、悬浮物、总碱度、水温、酸碱度等生态因子影响，其有效浓度难以掌控，且通过实验室检测方法测量养殖水体的药物浓度也不现实，生产中常因治疗浓度不够或过量而延误病情或产生毒副作用。生物监测是根据水生动物对化学物质敏感度不同的特性，利用其异常生理或行为参数变化，可直接判断水体毒性物质对水生动物潜在影响及毒性作用。若能够通过某种水生动物对硫酸铜的急性反应迅速判断当前药物浓度，对促进硫酸铜防病技术的推广应用将具有重要意义。【前人研究进展】目前，国内外利用大型蚤（Daphnia magna Straus）（Connon et al.，2008）、四膜虫（Tetrahymena spp.）（Sauvant et al.，1999；Aydin et al.，2015）、虹鳉（Poecilia reticulata）（Strigul et al.，2010）、剑尾鱼（Xiphophorus helleri）（Han and Fang，2010）、斑马鱼（Brachydanio rerio）（Yu et al.，2015）、青鳉（Oryzias latipes）（Liao et al.，2015）、黑头软口鲦（Pimephales promelas）（Mahler et al.，2015）、金鱼（Carassius auratus）（Feng et al.，2015）、锦鲤（Cyprinus carpio）（Li et al.，2015）、蓝鳃鱼（Lepomis macro-

chirus）（Barron et al.，2015）、稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）（Guo et al.，2015）等作为水生模型动物进行药物毒性试验、计算药物安全浓度、评价药物安全及有效性或监测水质污染程度等已得到广泛应用。指示生物或组织器官作为水体铜污染标记已成为水产研究的热点之一。如Shao等（2014）研究发现，异齿裂腹幼鱼（Schizothorax oconnori Lloyd）和拉萨裂腹幼鱼（Schizothorax waltoni Regan）对铜离子敏感，尤其是拉萨裂腹鱼非常适合作为水产养殖铜药物安全使用浓度的指示生物；Wu等（2015）通过检测莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）鳃上的Na+-K+-ATPase（NKA）活性，评估水产养殖使用铜制剂药物后鱼类的健康情况；Hu等（2015）研究发现，鳃上胆碱硫酸酯（Choline-O-sulfate）的变化也可作为红鲤暴露于铜离子污染水体中的生物标记。【本研究切入点】目前，硫酸铜在水产养殖应用中的药物剂量尚缺乏有效指示，但盲目用药可能会毒死养殖鱼类或因用量不够影响药效，因此有必要筛选出适宜的指示生物用于评估硫酸铜的药物浓度，为实际生产用药提供指导。【拟解决的关键问题】通过不同条件下的硫酸铜急性毒性试验、药效试验筛选出合适的鱼类指示生物，并結合实际生产，设计一套合理的生物指示硫酸铜药效的养殖病害防治办法，以期达到科学合理用药、保障水产品安全的目的，为促进硫酸铜防病技术在水产养殖中的推广应用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

硫酸铜（CuSO4·5H2O）购自上海埃彼化学试剂公司；麦穗鱼（Pseudorasbora parva）、斑马鱼、高体鳑鲏（Rhodus ocellatus）、锦鲤、尼罗罗非鱼（Tilapia niloticus）、鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）、草鱼（Ctenopharynodon idellus）、斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）等通过市场采购、江河采捕等方法引进实验室，按品种、合理密度隔离暂养于专用水泥池或水族箱中，保证充足溶氧、水质清新，其水温（23.0±0.5）℃，pH 7.3±0.2，以CaCO3计总碱度145±21 mg/L，以CaCO3计总硬度88±14 mg/L。每天投喂相当于鱼体重0.5%～1.0%的饵量，以30 min内吃完为宜。投喂饵料为人工配合饵料，蛋白水平在20%以上。隔离暂养30 d后筛选健康无异常鱼类进行试验，试验前3 d不再投喂饵料。主要仪器设备：生物显微镜（型号Eclipse50i，日本尼康公司）、便携式水质分析实验室（型号DR1900-05C，美国哈希公司）、温度计、便携式溶氧仪[型号YSI-550A，维赛仪器（北京）有限公司]、便携式pH计（型号FG2-ELK，瑞士梅特勒—托利多集团）、水族箱、单道可调量程移液器（型号Research Plus，德国艾本德股份公司）等。

1. 2 硫酸铜药效测试

药效试验在广西柳州市渔业技术推广站水生动物疫病防治实验室进行，以人工感染多子小瓜虫（Ichthyophthirius mulifiliis）、斜管虫（Chilodonella cyprini）、车轮虫（Trichodina spp.）的斑点叉尾鮰为研究对象，设养殖水体硫酸铜浓度为0.07、0.15、0.30、0.60和1.20 mg/L，放入人工感染后的斑点叉尾鮰各10尾，连续观察15 d。每种寄生虫设1个空白对照组，不进行药物处理。试验期间不喂料、不换水。

1. 3 不同硫酸铜浓度对不同鱼类的急性毒性试验

采用静水水生生物测试方法，设养殖水体硫酸铜浓度为0.30、0.60和1.20 mg/L，每个浓度处理分别放入麦穗鱼（规格4.82±0.74 cm）、斑马鱼（规格3.44±0.67 cm）、高体鳑鲏（规格3.77±0.36 cm）、锦鲤（规格12.37±1.22 cm）、罗非鱼（规格6.79±0.59 cm）、鲢鱼（规格15.74±1.09 cm）、草鱼（规格11.68±0.99 cm）、黄颡鱼（规格8.26±0.71 cm）各30尾，期间统计24和96 h平均死亡率。每个浓度处理均设1个空白对照组。试验期间不喂料、不换水。

1. 4 不同温度下硫酸铜对鱼类的急性毒性试验

固定养殖水体硫酸铜浓度为0.60 mg/L，通过恒温培养箱调节水温分别为（14.0±0.5）、（17.0±0.5）、（20.0±0.5）、（23.0±0.5）、（26.0±0.5）和（29.0±0.5）℃，每个温度处理分别放入麦穗鱼、高体鳑各30尾，期间统计24和96 h平均死亡率。每个温度处理均设1个空白对照组。试验期间不喂料、不换水。

1. 5 硫酸铜对麦穗鱼的急性毒性试验

设养殖水体硫酸铜浓度为0.07、0.15、0.30、0.60和1.20 mg/L，每个浓度处理分别放入30尾健康麦穗鱼，每2 h观察记录1次，连续观察24 h，期间按时段统计异常行为及平均死亡率。同时设1个空白对照组。试验期间不喂料、不换水。

1. 6 硫酸铜对不同时间段放入麦穗鱼的急性毒性试验

设养殖水体硫酸铜浓度为0.30和0.60 mg/L，从配好浓度时间开始计，按0、1、2、4、8和16 h后放入30尾健康麦穗鱼，每2 h观察记录1次，连续观察24 h（按投放麦穗鱼后开始计），期间统计24 h平均死亡率。同时设1个空白对照组。试验期间不喂料、不换水。

1. 7 池塘药效试验

试验地点为广西柳州市鱼峰区洛维园艺场水产养殖基地。选用的养殖池塘0.67 ha，放养有鲤鱼、鲫鱼、斑点叉尾鮰、鳙鱼、鲢鱼等品种，主养品种为鲤鱼（规格100～200 g），养殖密度12000尾/ha。正暴发斜管虫病，每天死亡鱼数约30尾。采用硫酸铜进行治疗，施药过程保持水体有效浓度在0.50～0.70 mg/L，每天施药1次，连续2 d。上午10：00采用0.70 mg/L硫酸铜均匀泼洒池塘后，立即在池塘四周投放4个分别装有10尾健康麦穗鱼的聚乙烯密封网笼（30目），4 h内密切观察麦穗鱼异常反应和死亡情况，药物治疗期间，每天用生物显微镜检查鱼塘内养殖鱼类体表和鳃部寄生虫情况2次。

2 結果与分析

2. 1 硫酸铜药效测试结果

以0.30 mg/L以上硫酸铜处理人工感染车轮虫的斑点叉尾鮰，可获得良好的防治效果，药物处理4 h后刮取鱼体表黏液镜检，无车轮虫活体检出。以0.60 mg/L以上硫酸铜处理人工感染斜管虫的斑点叉尾鮰，具有很好的防治效果，药物处理4 h后刮取鱼体表黏液镜检，无斜管虫活体检出；以0.07～0.30 mg/L硫酸铜进行处理，对斜管虫的杀灭效果不理想，15 d后鱼体仍有大量斜管虫寄生，且病鱼死亡率在60.00%以上（表1）。以0.15 mg/L以上硫酸铜处理人工感染多子小瓜虫的斑点叉尾鮰，即可获得良好的防治效果；硫酸铜处理浓度为0.15～0.60 mg/L时，病鱼身上白点在5 d后开始明显减少，15 d后无多子小瓜虫寄生。综合考虑硫酸铜的防治效果及其成本，确定0.60 mg/L为实验室环境下硫酸铜治疗多子小瓜虫、车轮虫、斜管虫等寄生虫病的适宜浓度。

2. 2 鱼类对不同硫酸铜浓度处理的急性毒性反应

由表2可以看出，8种受试鱼类在0.30、0.60和1.20 mg/L硫酸铜处理浓度下，只有麦穗鱼和高体鳑鲏表现出敏感和异常行为反应，死亡率在13.33%～100.00%，且以麦穗鱼更明显，因此可在短时间内根据麦穗鱼和高体鳑鲏的异常反应及平均死亡率来判断硫酸铜药效区间范围。

2. 3 不同温度下硫酸铜对鱼类的急性毒性作用

在不同温度下麦穗鱼、高体鳑鲏对硫酸铜耐受反应结果见表3。在水温14.0～26.0 ℃下，麦穗鱼对0.60 mg/L硫酸铜有很好的敏感反应，24 h内即大部分死亡或出现剧烈应激症状，死亡率在66.67%～100.00%；而高体鳑鲏敏感反应一般，死亡率在0～26.67%。水温超过26.0 ℃后，麦穗鱼、高体鳑鲏对硫酸铜的耐受力随温度的升高而增强；而水温低于26.0 ℃时麦穗鱼、高体鳑鲏对于硫酸铜的耐受力随温度变化不明显。

2. 4 不同浓度硫酸铜对麦穗鱼的急性毒性作用

麦穗鱼经0.07 mg/L硫酸铜处理24 h内无异常变化，经0.15 mg/L硫酸铜处理4 h内部分麦穗鱼体色变深，其4、8、16和24 h平均死亡率分别为0、0、6.67%和13.33%；经0.30 mg/L硫酸铜处理4 h内部分麦穗鱼有急游、翻转身体、体色变深等不适反应，24 h平均死亡率为33.33%；在0.60 mg/L硫酸铜浓度下，麦穗鱼刚放入即表现出明显的不适反应，4 h平均死亡率为53.33%；经1.20 mg/L硫酸铜处理4 h后麦穗鱼全部死亡（表4）。说明麦穗鱼对0.15 mg/L以上的硫酸铜浓度有明显敏感反应。

2. 5 硫酸铜对不同时段放入麦穗鱼的急性毒性作用

由表5可知，在0.30 mg/L硫酸铜浓度处理下，药物施放后立即放入麦穗鱼和1 h后放入麦穗鱼的24 h平均死亡率为33.33%，4和8 h后放入麦穗鱼的24 h平均死亡率为13.33%，16 h后放入麦穗鱼的24 h平均死亡率为零；在0.60 mg/L硫酸铜浓度处理下，药物施放4 h后放入麦穗鱼的24 h平均死亡率仍为80.00%，8 h后放入麦穗鱼的24 h平均死亡率为66.67%，16 h后放入麦穗鱼的24 h平均死亡率为16.67%。说明硫酸铜溶液配制后其药效随放置时间的增加而减弱。

2. 6 生物指示法评估体系的建立

在水温低于26.0 ℃的情况下，本研究从麦穗鱼、斑马鱼、高体鳑鲏、锦鲤、罗非鱼、鲢鱼、草鱼、黄颡鱼等8种供试水生动物中筛选出在硫酸铜杀虫浓度区间内敏感的指示生物是麦穗鱼，并建立了一套硫酸铜药效评估体系。评估体系主要是通过判断和统计4 h内麦穗鱼的异常反应及死亡情况，其间接指示硫酸铜药效浓度情况见表6。

2. 7 池塘药效试验结果

根据麦穗鱼的生物指示评估方法，于上午10：00时全塘泼洒0.70 mg/L硫酸铜后在池塘四周立即投入4个装有10尾健康麦穗鱼的聚乙烯网笼进行观察判定，结果显示4 h内麦穗鱼无反应，故判定水体硫酸铜浓度受环境因素影响，当次泼洒药物药效差。下午17：00时再次泼洒0.55 mg/L硫酸铜，池塘四周重新放置4个更换指示鱼的网笼，其4、8和16 h平均死亡率为37.50%、37.50%和50.00%，判定硫酸铜浓度在0.30～0.60 mg/L，药效较好，但因晚上不宜再次施药，故当日未进行0.10～0.40 mg/L药物二次处理。次日上午10：00时继续采用0.70 mg/L硫酸铜均匀泼洒池塘，四周重新放置更换指示鱼的网笼，其4、8和16 h平均死亡率分别为47.50%、55.00%和70.00%，判定硫酸铜浓度在0.60 mg/L左右，药效理想而无需进行药物二次处理。疗程结束后第2 d病鱼死亡数量明显减少，1周后无死亡现象发生；施药期间随机捕捞鲤鱼采样（鳃部和尾鳍）镜检，施药当天晚上虫体明显减少，第2 d下午开始无虫体检出。

3 讨论

硫酸铜已广泛应用于水产养殖业，常用剂量为0.50～0.70 mg/L（黄琪琰和宋承方，1992；周剑等，2014）。实验室条件下，以0.50～0.70 mg/L硫酸铜浓度治疗鱼类常见寄生虫病如多子小瓜虫、车轮虫、斜管虫等，治疗效果良好。但在实际生产中，由于硫酸铜受水体多种因子影响，施药浓度并不能达到实验室环境的用药浓度，造成治疗效果不稳定，养殖户时常根据生产经验盲目加大用量，毒死养殖鱼类的案例时有发生，损失惨重。因此，急需一种有效、直观的指示硫酸铜药效方法来指导水产养殖科学用药。Wu等（2015）研究发现，暴露在0.20 mg/L铜离子水体中时，罗非鱼鳃上的Na+-K+-ATPase（NKA）渗透调节功能会受到严重损害；而Hu等（2015）认为1.53 mg/L以上的铜离子浓度才能造成鱼类能量、氨基酸相关代谢的变化。这些方法都是采用原子吸收仪、核磁共振仪等进行标记物检测，检测工作仅适宜在实验室环境下操作，耗时长，测试的铜离子浓度范围非常有限，不适用于实际生产。

Shao等（2014）研究發现，异齿裂腹幼鱼和拉萨裂腹幼鱼暴露在铜离子水体中的96 h半数致死浓度分别为0.31和0.28 mg/L，即可通过这两种指示鱼尤其是拉萨裂腹幼鱼来判断生产养殖水体铜离子的安全浓度，但该研究缺乏进一步阐述生产应用方法。本研究通过筛选获得0～1.20 mg/L硫酸铜浓度下有敏感反应的指示鱼类——麦穗鱼。虽然国内也有关于铜离子对麦穗鱼的急性毒性研究，如宋维彦和解相林（2010）研究发现，铜离子对麦穗鱼的24 h半数致死浓度为0.283 mg/L，说明麦穗鱼对铜离子非常敏感；王晓南等（2013）研究表明，铜离子对麦穗鱼的96 h半数致死浓度为0.101 mg/L，麦穗鱼是环境监测中较理想的指示生物，同时也是潜在的水质基准受试生物。但这些研究仅为某一温度下的结果测试，对不同条件下铜离子毒性对麦穗鱼产生的直观影响没有进行更多描述，对生产用药的指导意义不明显。为此，本研究不仅探索硫酸铜对麦穗鱼的急性毒性反应，还结合不同浓度、不同温度、不同时段麦穗鱼的反应情况作为评估依据，建立硫酸铜药效浓度评估方法，且评估方法直观、便捷、廉价、易于操作，对指导养殖户科学判断硫酸铜的有效浓度具有重要意义。

4 结论

麦穗鱼可作为水产养殖中硫酸铜治疗寄生虫病药效浓度的指示生物，在保证溶氧的条件下于施药后4 h内投放麦穗鱼进行行为、异常情况观察，可评估硫酸铜药效浓度情况，为生产管理提供科学参考和用药指导。

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（責任编辑 兰宗宝）