初探在RSK4变异体3的相互作用蛋白

●田斯琦 刘日强 杨华伟

初探在RSK4变异体3的相互作用蛋白

●田斯琦 刘日强 杨华伟

目的：寻找RSK4(核糖体S6蛋白激酶4)第3变异体的相互作用蛋白，以便于为后续研究其分子机制及在乳腺癌中的功能做铺垫。 方法：构建RSK4变异体3（RSK4m3）的过表达慢病毒，稳定转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞中，使用蛋白印迹实验与实时荧光定量PCR检测变异体的蛋白及mRNA的表达情况，通过质谱鉴定找出互作蛋白。结果：稳定转染后，RSK4变异体的蛋白及mRNA表达水平均上调，质谱结果分析找出与RSK4m3有相互作用的Creb,insulin,Ppp2c等蛋白。结论：RSK4m3可能与Creb,insulin,Ppp2c有直接相互作用关系。

乳腺癌；RSK4;变异体；相互作用蛋白

乳腺癌，一个人们闻之色变的名词，根据最新的统计数据[1]，在中国每年的新诊断出的乳腺癌病例及死亡病例分别占全球的12.2%和9.6%，这一数值的持续升高，加速着我们对乳腺癌研究的不断深入。Berns K[2]及SUN Y[3]等人先后证明了，RSK4是抑制乳腺癌侵袭转移的重要因子，它能够抑制乳腺癌细胞的生长并诱导其衰老,但对于其通过mRNA可变剪接作用下行成的RSK4的变异体（RSK4 variants，RSK4m）我们却知之甚少。RSK4共有3个剪接变异体[3]，RSK4m3为其的第三变异体，缺失第19外显子的15个碱基和第21外显子，缺失碱基最多，研究也最有意义。本研究旨在寻找RSK4m3的相互作用蛋白，为今后研究其作用机制及生物学功能提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）细胞系：人乳腺癌细胞株MDA-MB-231于里苏（上海）生物技术有限公司购买。

（2）主要试剂：Leibovitz’s L-15培养液于吉诺生物医药技术有限公司购买；阴性对照病毒CON145及RSK4m3慢病毒过表达载体LVRPS6KA6(9076-2)购于上海吉凯基因化学技术有限公司；β-actin内参和RSK4引物均由华大基因科技服务有限公司合成；抗RSK4抗体和山羊抗兔二抗购自Bioworld公司，GAPDH 抗体及小鼠二抗购于上海康臣生物公司。

1.2 方法

（1）构建RSK4变异体3的过表达慢病毒载体：根据NCBI中RSK4 的cDNA（NM_014496.4）为模板，切除第19外显子的15个碱基和第21外显子，通过PCR扩增出RSK4m3的基因，对其进行琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收。进行摇菌培养后，于37℃培养箱培养过夜，提取RNA进行鉴定。

（2）细胞培养及稳定过表达细胞株的构建：将MDA-MB-231细胞接种至六孔板中，吹打铺匀，当细胞密度达到70%-80%的时候进行慢病毒转染，弃上清，放入培养箱。12小时后取出，去上清，加入新鲜培养基继续培养。分别在24,48,72和96小时时观察荧光蛋白的表达。设计3组，一个未转染病毒对照组（con组），一个转染阴性病毒对照组（mock组），一个过表达RSK4m3慢病毒组（OE组）。

（3）实时荧光定量PCR检测mRNA的表达

通过Primer5.0设计出β-actin和RSK4m3的引物序列：

β-actin∶ F 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’, R 5’-C T C C T T A A T G T C A C G C A C G A T-3’; R S K 4 m 3∶F 5’-C A G C C A G T G C A A A T G C T C A T C-3’, R 5’-GGAGCCAACACCAATATCCTC-3’。提取细胞总RNA，后逆转为cDNA。根据SYBR Green 试剂盒进行qRT-PCR检测。根据数据计算CT值，以2-△△CT来表示mRNA的相对表达量，根据如下计算公式，△CT=CT平均值RSK4-CT平均值actin，△△CT=△CTOE-△CTMOCK。

（4）免疫印迹检测蛋白表达：在细胞稳定转染72小时后取出，PBS冲洗3遍提取总蛋白，测浓度。用聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，以25ug/孔进行蛋白上样，跑近胶底后，以15V的恒压半干转至PVDF膜，1h后取出封闭，RSK4一抗（1：1000）4°C孵育过夜，TBST清洗3遍，二抗孵育1小时。洗膜后发光，用BIO-RAD化学发光仪检测分析。

（5）质谱（LC-MS/MS）分析：对蛋白样品进行电泳，后进行考马斯亮蓝染色，取玻璃板，将胶置于板上，切割蛋白条带所在位置的胶，放入EP管中。加入三蒸水，震荡10min（700rpm）3次。加入脱色液，振荡直至无色。后加入三蒸水（1ml）振荡10min重复3次，使用纯乙腈脱水3次。按0.5±0.05ug/ul加入typsin,覆盖干胶，37℃振荡过夜。吸取酶解液至新管，将提肽液放入EP管将其覆盖，超声振荡20min，吸出液体与酶解液混合，混匀液置于真空干燥仪，直至完全干燥。样品除盐，后进入C18反相柱，以0.5ul/min流速分离，继而依据设定的线性梯度分离，大于90min.终样品由LTQ-Orbitrap质谱仪鉴定。

（6）对质谱结果进行生物信息学分析：根据uniprot找出蛋白编号，进行IPA分析并绘制了相应的蛋白—蛋白相互作用网络图。

（7）统计学分析：使用SPSS19.0统计分析软件对数据进行统计分析，结果均以均数`x±s表示，采用t检验，p＜0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

（1）RSK4m3mRNA的表达：PCR结果经t检验，差异有统计学意义（p=0.024＜0.05,t=6.379）。（图1）

图1 转染细胞中RSK4变异体的mRNA的过表达检测

（2）RSK4m3的蛋白表达：免疫印迹结果显示，RSK4蛋白在con组和mock组中表达量极低，仅在转染了变异体慢病毒的OE组中表达增强。（图2）

（3）经串联亲和纯化后的质谱鉴定及生物学分析：经过分析，我们发现RSK4m3与Creb,insulin,Ppp2c有相互作用。（图3）

图2 rsk4变异体在蛋白水平过表达的检测

图3 RSK4变异体相互作用蛋白的网络分析图

3 讨论

乳腺癌是威胁全球妇女身心健康的重大疾病，每年都有超过100万的女性患上该病，并且约有41万人死于次病[4]。RSK4对乳腺肿瘤细胞的发生发展有着重要的影响，针对该因子的其变异体的研究，我们可以得到新的诊断指标，对乳腺癌的生长速度，恶性程度，发展趋势及病程结果预测有更精确的判断能力，使我们可以根据个体情况制定更有针对性的治疗靶点提高治疗特异性。

（作者单位：广西医科大学附属肿瘤医院）

[1] 李媛秋. 中国癌症发病率预测统计方法研究[D]. 北京协和医学院,2011.

[2] K B, E H, J M, et al. A large-scale RNAi screen in human cells identifies new components of the p53 pathway[J]. Nature,2004(428)∶431-437.

[3] Sun Y, Cao S, Yang M, et al. Basic anatomy and tumor biology of the RPS6KA6 gene that encodes the p90 ribosomal S6 kinase-4[J]. Oncogene,2013,32(14)∶1794-1810.

[4] L Fan，K Strasser-Weippl，Jj Li. Breast cancer in China[J]. Lancet Oncol,2014(15)∶279-289.

田斯琦，女，硕士，研究方向为乳腺癌的临床与基础研究。