TcLr24小麦NBS-LRR同源基因的克隆与分析

谢　欢，周　颖， 杨文香，张　娜，刘大群

(河北农业大学 植物保护学院 植物病理系，河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心，国家北方山区农业工程技术研究中心, 河北保定　071001)



TcLr24小麦NBS-LRR同源基因的克隆与分析

谢欢，周颖， 杨文香，张娜，刘大群

(河北农业大学 植物保护学院 植物病理系，河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心，国家北方山区农业工程技术研究中心, 河北保定071001)

摘要目前已克隆的小麦抗叶锈病基因多数含有NBS类保守结构域，为克隆高抗叶锈病 Lr24基因及其抗病相关基因，根据NBS保守结构域设计引物，对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr24 cDNA进行扩增，得到534 bp的抗病基因同源序列。对该序列进行同源性检索并验证，获得1 408 bp的电子延伸序列。以此通过RACE 技术分别获取2 797 bp 和3 466 bp的cDNA与gDNA全长产物，其翻译的蛋白质序列含有NBS保守区的P-loop、Kinase 2a、Kinase 3a、HD和LRR保守结构，与大麦等单子叶植物NBS类蛋白序列同源性较高，生物信息学分析表明其为稳定的亲水性蛋白，分子质量104.28 ku，理论等电点6.15。半定量RT-PCR表明该片段所在基因序列为组成型表达。

关键词小麦；TcLr24；抗病基因同源序列；NBS

小麦(TriticumaestivumL.)叶锈病在世界各产麦区均有发生，是小麦的主要病害之一，严重时可造成15%～40%甚至更大的产量损失[1]。合理利用抗病品种是该病害防治中最安全、经济和有效的方法。抗病基因和抗病相关基因的克隆对病原物与寄主互作研究及抗病品种的培育具有重要意义。

同源序列法是分离克隆基因最经济、快捷的途径之一，其中NBS-LRR类抗病基因类似序列是单子叶植物抗病基因最大的一类，目前已经从多种经济作物和粮食作物中分离获得大量NBS类抗病基因同源序列，并且通过同源序列法结合图位克隆法从小麦中克隆获得的抗叶锈病基因 Lr1[2]、 Lr10[3]、 Lr21[4]均含有NBS-LRR结构。因此，NBS类抗病相关基因同源序列的分离对抗病基因的分离克隆具有重要意义。

小麦抗叶锈病基因 Lr24在生产上已表现出较好的抗叶锈性，具有很大的应用潜力。该基因目前获得多个相关的分子标记[5]；利用RACE方法获得编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、受体激酶、LRR-受体激酶的基因，并用基因沉默技术对3个激酶基因进行初步的功能分析。分离获得 Lr24介导抗病性所必需的TaRAR基因[6]。此外，张立荣等[7]从TcLr24中获得2 822 bp的cDNA全长RGA1Q，其编码产物具有NBS、LRR等抗病基因保守结构域，在TcLr24基因组中呈单拷贝、组成型表达。这些研究对 Lr24基因的辅助选择及抗病育种、基因分离及其相关功能研究具有指导意义和应用价值。但是，抗病基因及其相关基因多以基因簇存在，因此要分离克隆抗病基因还需大量工作。本研究根据NBS类抗病基因保守结构合成简并性引物，利用PCR结合RACE技术，从叶锈菌诱导的小麦叶片cDNA中扩增抗病基因同源序列，以期为克隆抗病相关基因奠定基础。

1材料与方法

1.1材料选择与处理

选用小麦抗叶锈病单基因系TcLr24盆栽，待幼苗长至1叶1心时分别接种对TcLr24表现低毒力的叶锈菌单孢菌系88-26-12-4(BGQQ)，另设不接菌对照，分别于处理0、6、12、24、48、72和96 h取试验材料。

1.2主要方法

1.2.1NBS类抗病基因同源片段的分离将接菌处理TcLr24样品不同时间点的RNA样品等量混合成总RNA池，参照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)说明书合成反应所需的cDNA第1链。以根据NBS类保守结构域GGVGKTT和GLPLAL合成的引物，对cDNA模板进行扩增。

1.2.2NBS类抗病基因同源序列的RACE扩增以TcLr24 cDNA扩增出的534 bp片段为靶序列电子延伸至1 408 bp，并以此分别设计3′端正向基因特异引物(5′-CTTGTTCAATCAGGGA- TGGCCTTGGATA-3′)和5′端反向基因特异性引物(5′-GCTCAAGAACAGTTCCCATGAAG-CATCG-3′)，按照RACE 试剂盒(Clontech)使用说明进行操作，分别对其进行3′RACE和5′RACE扩增，对PCR反应产物分别进行克隆及测序。

1.2.3RACE序列的拼接和验证利用DNAMAN软件将所获得的5′和3′端的cDNA序列与已知靶序列进行拼接，并预测拼接序列的开放阅读框，在开放阅读框两端设计全长验证引物Y61QCYZ124和Y61QCYZ2920，以TcLr24的cDNA和gDNA为模板进行扩增。PCR产物进行回收测序，将获得的cDNA序列进行生物信息学分析。

1.2.4半定量RT-PCR分析选取在小麦中组成型表达的基因Actin作为内标，通过调整模板质量浓度，使内标基因的PCR扩增产物量一致，用于基因的表达分析。

2结果与分析

2.1同源序列的扩增及序列分析

用NBS类R基因简并性引物，以TcLr24的cDNA为模板进行扩增，获得1条500 bp左右的目的片段(图1)，与预期片段大小相同。将目的条带进行回收克隆，片段经测序长534 bp，全序列与大麦NBS-LRR 抗病蛋白b1部分序列同源性92%。

根据与534 bp序列同源的大麦1 455 bp(118～1 454 bp为完整的ORF序列)序列设计引物，对TcLr24的cDNA进行扩增，经测序拼接后序列长为1 408 bp，将该序列向3′端延长874 bp。该序列翻译后通读，含有NB-ARC保守结构。

以1 408 bp为靶序列，使用设计的3′端正向基因特异引物和5′端反向基因特异引物，应用Touchdown PCR进行扩增，经检测分别获得1 528 bp 的3′端产物和1 129 bp的5′端产物。与靶序列拼接后获得全长为3 087 bp的片段(命名为Y61)，编码919个通读的蛋白质氨基酸序列。具有148 bp的5′非翻译区，150 bp 的3′非翻译区和29 bp的多聚腺苷酸尾。该序列翻译的蛋白质序列含有NBS保守区的P-loop、Kinase 2a、Kinase 3a、HD保守结构和LRR保守结构。

M. DL2000

2.2全长cDNA和DNA的获得

在拼接序列的开放阅读框两端设计全长验证引物QC124和QC2920，并以TcLr24的gDNA、cDNA为模板进行PCR扩增，在gDNA和cDNA中均获得1条3.0 kb左右(3 466 bp，2 797 bp)的扩增片段 (图2)，分别克隆测序，并将序列提交到NCBI比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/)，显示该基因含1个长为669 bp的内含子，2个长分别为655 bp和2 142 bp的外显子。

M. DL2000

2.3生物信息学分析

2.3.1序列同源性分析及系统发育树的构建将所获得cDNA全长序列在NCBI数据库进行BLASTx分析，结果显示，其所编码蛋白与大麦(H.vulgare)、山羊草(Aegilopstauschii)、谷子(Setariaitalica)、小麦(T.aestivum)、燕麦(Avenasativa)、玉米(Zeamays)等植物的NBS-LRR抗病蛋白的同源性较高(图3)。进一步采用Mega4构建其与其他植物抗病相关蛋白的进化树(图4)，发现种间距离Y61与山羊草(EMT01263.1)遗传距离最近。

2.3.2Y61编码蛋白质氨基酸的结构分析利用SMART软件进行保守域预测，该序列包含1个NB-ARC结构域(N端191-450)和2个富含亮氨酸基序(LRR，562-595)，且含有2段简单组分结构，每个LRR序列含有22～24个氨基酸。

使用 Neural Networks(NN)和Hide Markov Models( HMM)2种模型对Y61氨基酸序列进行信号肽切割位点的预测，结果表明，Y61蛋白为非分泌性蛋白，不存在信号肽的切割位点。利用TMHMM预测Y61蛋白全长氨基酸序列的跨膜结构域，发现该序列不存在跨膜信号。

图3　Y61蛋白序列与NBS-LRR蛋白序列比较

图4　Y61蛋白与其他植物NBS-LRR抗病蛋白序列聚类分析

利用ProtScale工具对Y61蛋白的疏水性进行分析，除在第800位氨基酸后有1个较大的亲水区，表明该蛋白是亲水性蛋白。ProtParam分析蛋白序列，其中亮氨酸(L)最多，有131个，占氨基酸总数的14.3%。该蛋白的分子质量为104.28 ku，等电点6.15，平均疏水性(grand average of hydropathicity，GRAVY)为-0.137。不稳定系数(Instability index)为40.01，表明该蛋白性质稳定。

利用ExPaSy中的SOPMA软件预测Y61蛋白的二级结构，结果显示，该蛋白含约61.48%的α-螺旋(α-helix，H)、2.29%的β-转角(β-turn，T)、27.53%的无规则卷曲(random coil，C)和8.71%的延伸链(Extended strand，E)。

2.4同源序列的半定量RT-PCR

以Actin为内标引物对TcLr24接菌处理0、6、12、24、48、72和96 h后的cDNA进行扩增，调整不同时间点cDNA的质量浓度(图5-A)。用该基因特异性引物对TcLr24不同时间点的cDNA进行扩增，表明不同时间点扩增量未见明显差异(图5-B)，说明该片段所在基因序列为组成型表达。

A.Actin内标引物　Actin internal control primers；B. NBS特异引物　NBS specific primers

3讨 论

NBS-LRR类R基因在已知的抗病基因中占很大一部分。NBS结构域由3个区域组成，其中，第1区域为磷酸结合环(P-Loop)，又称激酶(Kinase)la， 主要与ATP或GTP的磷酸结合；第2区域为激酶(Kinase)2a；第3区域为激酶(Kinase)3a，与核糖或DNA的嘌呤结合有关。根据其结构分析，抗病基因在行使抗病功能时需要结合ATP或GTP。拟南芥RPM1基因的NBS区的点突变使其在转基因植株中不能诱导过敏性反应[8]，而烟草N基因中20多个NBS区的氨基酸的代换，一些代换使N基因丧失部分抗性，而另一些则使抗病性完全丧失[9]。因此，抗病基因的NBS保守结构域可能与病原诱发子或激发子(elicitor)及抗病基因信号传导的下游蛋白的相互作用的特异性有关[10]。LRR中单一氨基酸的变化都会导致抗病反应消失或减弱[11]。

本研究从TcLr24中获得全长3 087 bp的NBS类小麦抗病基因同源序列，包含完整NBS结构域，且含有NBS-LRR类抗病基因的高度保守区，LRR区域与大麦LRR仅有1个氨基酸差异(第359位氨基酸)，可能在该位点存在碱基替换，但二者功能是否一致尚未知。此外，通过与粗山羊草、玉米、大麦、燕麦、谷子及前人从小麦中获得的NBS-LRR类蛋白进化树分析发现，该研究获得序列与粗山羊草和谷子的序列较近，而与其他几个单子叶植物的抗病蛋白类似物同源性较低。任晓娣等[12]、张楠等[13]研究也发现，即使从同一材料(TcLr19)分离得到的不同抗病基因类似物，其同源性高低也不完全相同；另外，不同抗叶锈病基因NBS-LRR结构的同源性也比较低[12]。因此，其与 Lr24抗病基因的关系还需进一步连锁分析、功能鉴定等才能确定。该目的基因的获得及其生物信息学分析，为进一步研究该基因功能提供理论参考。

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ZHANG L R,YANG W X,LIU D Q.Cloning and character of resistsnce homologenes contained NBS-LRR in wheat TcLr24[J].JournelofPlantGeneticsResources,2011,12(3):431-436 (in Chinese with English abstract).

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REN X D,LIU Y H,LI J Y,etal.Cloning and expression analysis of a NBS-LRR resistance gene homology cDNA sequence from wheat[J].JournelofAgriculturalUniversityofHebei,2013,36(2):69-74,79 (in Chinese with English abstract).

[13]张楠,王海燕,刘大群.小麦NBS类抗病基因同源cDNA序列的克隆与特征分析[J].植物遗传资源学报,2010,11(5):605-610,615.

ZHANG N,WANG H Y,LIU D Q.Cloning and characterization of a NBS resistance gene homology cDNA sequence from wheat[J].JournalofPlantGeneticResources,2010,11(5):605-610,615 (in Chinese with English abstract).

Received 2015-07-01Returned2015-10-08

Foundation itemNational Program on Key Basic Research Project (973 Program) (No.2013CB127700); Doctoral Foundation of Ministry of Education of China (No.20101302120005); Science and Technology Research Projects of Hebei Educational Committee (No.Q2012010).

First authorXIE Huan, female, master student. Research area: molecular plant pathology. E-mail: xiehuan1020@foxmail.com

LIU Daqun,male,professor,Ph.D.Research area:molecular plant pathology and bio-control of plant disease.E-mail:ldq@hebau.edu.cn

(责任编辑：郭柏寿Responsible editor:GUO Baishou)

Isolation and Characterization of NBS-LRR Homologue from TcLr24

XIE Huan, ZHOU Ying, YANG Wenxiang, ZHANG Na and LIU Daqun

(Department of Plant Pathology, Agricultural University of Hebei, Biological Control Center of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province, National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas, Baoding Heibei071001,China)

AbstractConserved domain of NBS is mostly contained in the cloned wheat leaf rust resistance (Lr) genes. In order to clone high resistant gene Lr24 and its related genes, NBS like conserved primers were designed and 534 bp target fragment was isolated from cDNA of TcLr24,1 408 bp electronic extended sequence was acquired and verified. Then full-length products with 2 797 bp and 3 466 bp were isolated from cDNA and gDNA of TcLr24, respectively. It showed high homology to some NBS type resistance protein like Hordeum vulgare. Conserved domain of P-loop,Kinase 2a,Kinase 3a, and HD of NBS, and LRR domain were contained in this sequence. Bioinformatics analysis showed it was a hydrophilic protein with good stability, and with molecular weight 104.28 ku and theoretical isoelectric point 6.15. It implied the constitute expression model of this gene by semi-quantitative RT-PCR. The results provide basis for further study on cloning the leaf rust resistance genes in wheat.

Key wordsWheat; TcLr24; Resistance genes homologous sequences; NBS

收稿日期：2015-07-01修回日期：2015-10-08

基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划)(2013CB127700)；教育部高等学校博士点基金(20101302120005)；河北省高等学校科学技术研究计划(Q2012010)。

通信作者：张娜，女，副教授，博士，研究方向为分子植物病理学。E-mail: zn0318@126.com

中图分类号S435

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)04-0518-05

Corresponding authorZHANG Na, female, associate professor, Ph.D.Research area:molecular plant pathology.E-mail:zn0318@126.com

网络出版日期：2016-04-02

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1111.012.html

第一作者：谢欢，女，硕士，研究方向为分子植物病理学。E-mail: xiehuan1020@foxmail.com

刘大群，男，教授，博士，研究方向为植物病害生物防治和分子植物病理学。E-mail: ldq@hebau.edu.cn