同步抑制棉叶螨TtAK与TtCHI基因表达的RNAi载体的构建

耿文超，赵伊英，刘　峰，汪小东，李艳军，孙　杰

(石河子大学 农学院，新疆石河子　832000)



同步抑制棉叶螨TtAK与TtCHI基因表达的RNAi载体的构建

耿文超，赵伊英，刘峰，汪小东，李艳军，孙杰

(石河子大学 农学院，新疆石河子832000)

摘要为在植物中表达针对棉叶螨精氨酸激酶基因TtAK与几丁质酶基因TtCHI的双链RNA，以改良植物对棉叶螨的抗性。采用PCR技术，分别扩增获得靶标基因TtAK与TtCHI的功能区域片段453 bp与610 bp，通过PCR引物引入特定的酶切位点，采用DNA标准重组技术与Gateway技术相结合的方法，以RNA干扰载体pB7GWIWG2(Ⅱ)为基础，成功构建出针对棉叶螨TtAK与TtCHI基因的RNAi载体。为遗传转化棉花，改良棉花对棉叶螨的抗性奠定基础。

关键词TtAK基因；TtCHI基因；Gateway技术；RNA干扰；载体构建

新疆棉花主要害螨为土耳其斯坦叶螨(Tetranychusturkestani)，该螨属蛛形纲蜱螨目叶螨科，广泛存在于所有棉花种植区。其主要集中在棉花叶片背面，吸取汁液，自下而上造成棉株红叶，抑制棉花的生长发育，并且引起蕾铃大量的脱落。近年来，新疆棉区棉叶螨繁殖、扩散速度快，虫口密度大，呈偏重发生态势，危害严重时可造成棉田减产30%以上[1]。长期依赖化学药剂防治，不但使棉叶螨的抗药性增强，而且还杀死大量有害螨的天敌。因此，通过培育抗叶螨棉花品种来降低棉叶螨的危害程度，是新疆棉花生产亟待解决的一个重要问题。

近年来，通过转基因的方法让植物体内表达昆虫基因的双链RNA(dsRNA)，当植食性昆虫取食进入到昆虫体内，从而抑制昆虫相应靶标基因，表达的RNAi技术已应用于改良植物抗虫性[2-7]。在昆虫中，那些编码重要蛋白功能的基因是RNAi很好的靶标；在植物中表达针对这些基因的dsRNA，通过昆虫取食植物时，能够特异地抑制相应昆虫关键功能基因的表达，从而导致昆虫的生长、发育以及繁殖的缺陷，甚至可以杀死昆虫[2-7]。在无脊椎动物的生命活动过程中，精氨酸激酶(Arginine Kinase,AK)是参与能量代谢的关键酶[8]；它仅存在于无脊椎动物的身体组织中，如肠上皮细胞、肌肉纤维等，是无脊椎动物体内唯一的磷酸原激酶；在其肌肉中，磷酸精氨酸是唯一有效形成ATP的磷酰基供体，能在一定时间内给剧烈运动的肌肉提供能量，同时又维持ATP的恒定水平，在细胞能量代谢中发挥着重要作用[9-10]。由于精氨酸激酶仅存在于无脊椎动物中，并且该酶及其磷酸原的能量代谢途径与哺乳动物中的完全不同，因此针对该酶的抑制剂不会对人类造成危害。土耳其斯坦叶螨精氨酸激酶基因TtAK可作为植物介导的RNAi控制其危害的一个很好的敏感靶标。此外，几丁质酶(Chitinase，CHI)是昆虫发育过程中用来确保蜕皮的完成及外骨骼围食膜和气管等再生的重要酶[11-12]，是昆虫表皮、气管和中肠围食膜的重要组成成分，约占昆虫蜕干物质的40%[13]，对昆虫的生长发育起着至关重要的作用[12]。因此，通过植物介导的RNAi技术抑制叶螨的几丁质酶基因TtCHI表达，从而破坏其正常的生长发育过程，进而起到防治棉叶螨的作用，具有重要的意义。

本研究以植物介导的RNAi技术为前提，对棉叶螨2个靶标基因TtAK与TtCHI进行功能区域序列分析和比较，利用PCR技术分别扩增获得的TtAK与TtCHI的靶标片段，通过引物引入的特定酶切位点，采用DNA重组技术和Gateway 技术，构建出双基因的RNAi载体，为进一步遗传转化棉花等作物，进而为改良作物对棉叶螨的抗性奠定基础。

1材料与方法

1.1材料、菌株及主要试剂

棉叶螨基因TtAK与TtCHI由石河子大学农学院昆虫实验室提供[14-15]；大肠杆菌菌株EscherichiacoliTOP10、RNAi载体pB7GWIWG2 ((II)、根瘤农杆菌菌株AgrobacteriumtumefaciensLBA4404均为新疆兵团绿洲生态农业重点实验室保存。

ExTaq酶和高保真DNA聚合酶PrimeSTARTM、克隆载体pMD18-T simple vector均购于大连宝生物有限公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶、DNA凝胶回收试剂盒和DNA分子量标准Marker购自TaKara公司；试剂盒pENTRTMDirectional TOPO○RCloning Kits 和Gateway LR ClonaseTMⅡEnzyme Mix购于Invitrogen公司；抗生素等购自北京索来宝生物有限公司；其他试剂均为国产和进口分析纯。

1.2靶标基因功能区域片段的克隆

以前期已克隆获得的TtAK与TtCHI基因序列为基础，选取相应的RNAi靶标区域，分别设计出特异性引物，正向引物AK-F：5′-GCTCAATACAAAGAAATGGAAG-3′；反向引物AK-R：5′-CTTCTTGTCAGCAGCAAGTTTAG GT-3′；正向引物CHI-F：5′-AAGCTTGCATGCCTGCAGGTC-3′(划线部分为Hind Ⅲ酶切位点)；反向引物CHI-R：5′-TCGATTGGATA- GAGATATTTGG-3′。 引物由华大生物工程(北京)股份有限公司合成。分别以获得的2个棉叶螨基因cDNA为模板进行PCR反应。扩增条件为94 ℃ 5 min，30个循环(94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min)，72 ℃ 10 min。胶回收操作步骤参照百泰克生物公司胶回收试剂盒说明书。并且参照TaKara公司试剂盒说明，将回收的目的片段连接到pMD18 vector上，分别获得pMD18-AK载体与pMD18-CHI载体。转化大肠杆菌菌株E.coliTOP 10感受态细胞，筛选抗Amp菌落，同时进行菌液PCR鉴定和酶切鉴定。

1.3同步沉默双基因的RNAi载体的构建

利用标准DNA重组技术与Gateway技术相结合的方法来构建质粒载体。用Hind Ⅲ酶切pMD18-CHI载体(pMD18 vector上带有单一的Hind Ⅲ酶切位点，CHI扩增的正向引物设计1个Hind Ⅲ酶切位点)，回收TtCHI靶标片段(610 bp)。同时，用Hind Ⅲ酶切pMD18-AK载体，回收线性大片段，为防止线性大片段产生自连现象，将收回的片段在磷酸酶作用下去磷酸化。然后将去磷酸化的大片段与回收TtCHI靶标片段(610 bp)在T4DNA连接酶进行连接，转化E.coliTOP10感受态细胞后，挑取Kan抗性菌落，提取质粒并进行酶切鉴定，同时利用正向引物AK-F与反向引物CHI-R进行PCR扩增鉴定双基因的连接方向，验证后获得pMD18-AK-CHI。

设计TtAK与TtCHI基因融合靶标片段的特异性引物，AK-CHI-F：5′-CACCGCTCAAT- ACAAAGAAATGG-3′；AK-CHI-R：5′-TCGA- TTGGATAGAGATATTTGG-3′。在正向引物前加上CACC接头，利用PrimeSTARTMHS DNA聚合酶对重组质粒pMD18-AK-CHI进行PCR扩增，扩增反应体系为(总体系50 μL)：5×PrimeSTAR 酶0.5 μL，5×PrimeSTAR buffer 10 μL，dNTP 4 μL，引物AK-CHI-F 1 μL，引物AK-CHI-R 1 μL，模版DNA(稀释5倍)0.5 μL，加ddH2O补足至50 μL。扩增条件为94 ℃ 5 min，30个循环(94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min)，72 ℃ 10 min。回收扩增获得的平末端PCR产物，与pENTR/D-TOPO载体进行TOPO定向克隆；转化大肠杆菌菌株E.coliTOP10，筛选抗Kan菌落，同时进行菌落PCR鉴定和测序分析。利用Gateway技术，取测序结果正确的质粒进行LR反应，在0.5 mL离心管中加入以下反应体系(总体积4.5 μL)：TOPO定向克隆获得的入门载体2 μL，pB7GWIWG2(Ⅱ) 载体质粒2 μL，LR反应酶0.5 μL，瞬时离心将混合体系于25 ℃过夜后，加0.5 μL Proteinase K，37 ℃ 10 min 终止反应。转化E.coliTOP10感受态细胞后，挑取Spec抗性的菌落进行PCR鉴定，获得 pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHI载体(图1)。通过电击转化法将pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHI载体导入到根瘤农杆菌菌株AgrobacteriumtumefaciensLBA4404中,挑取Spec抗性的菌落进行PCR鉴定。

2结果与分析

2.1靶标基因功能区域片段的克隆

以前期已克隆得到的TtAK与TtCHI基因序列为基础，分别利用特异性引物PCR扩增，获得453 bp 和610 bp的条带(图2)。将回收的目的片段分别连接到pMD18 vector上，转化大肠杆菌菌株E.coliTOP10感受态细胞，筛选抗Amp菌落，提取质粒进行酶切鉴定。酶切目的片段与预期结果一致(图3)。选取阳性克隆送往华大公司测序，结果表明，扩增的序列为TtAK与TtCHI基因靶标片段(图4、图5)。

图1　pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHI载体的构建示意图

2.2同步沉默双基因的RNAi载体的构建

用Hind Ⅲ酶切pMD18-CHI载体；由于pMD18 vector上带有单一的Hind Ⅲ酶切位点，同时CHI扩增的正向引物设计了1个Hind Ⅲ酶切位点，所以酶切后回收pMD18-CHI的610 bp小片段；同时用Hind Ⅲ酶切pMD18-AK载体，回收线性大片段后去磷酸化。采用标准DNA重组技术，用T4DNA连接酶连接2个回收的片段。将其转化大肠杆菌菌株感受态细胞，挑取抗性菌落，利用融合靶标片段的特异性引物进行PCR扩增。提取阳性质粒，用Hind Ⅲ等酶切进行分析。PCR与酶切验证获得pMD18-AK-CHI载体(图6、图7)。

图2PCR扩增靶标基因功能区域片段

Fig.2PCR amplification of target genes

利用Gateway重组技术，通过 PrimeSTARTMHS DNA聚合酶对重组质粒pMD18-AK-CHI的融合靶标片段进行PCR扩增，获得的平末端PCR产物，与pENTR/D-TOPO载体进行TOPO定向克隆；转化大肠杆菌菌株E.coliTOP10，筛选抗Kan菌落，同时进行菌落PCR鉴定和测序分析。将测序结果正确的入门克隆与RNAi载体pB7GWIWG2(Ⅱ)的重组位点在LR cloneⅡenzyme的催化下，进行LR反应。将AK-CHI的融合靶标片段以反向重复的形式插入到pB7GWIWG2(II)载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，挑Spec抗性单克隆进行菌落PCR 检测(图8)。提取阳性单克隆的质粒。通过XbaI 与SacIM.Marker DL 2 000; 1～3.TtAK基因的PCR产物PCR products ofTtAKgene; 4～6.TtCHI基因的PCR产物PCR products ofTtCHIgene

M.Marker DL 2 000; 1.HindⅢ与SacⅠ双酶切pMD18-AK载体Fusion fragment PCR of pMD18-AKdigested byHindⅢ andSacⅠ; 2.HindⅢ酶切单pMD18-CHI载体Fusion fragment PCR of pMD18-CHIdigested byHindⅢ

图3PCR扩增靶标基因功能区域片段

Fig.3PCR amplification of target gene

图4　已克隆获得 TtAK 靶标基因功能区域片段

图5　已克隆获得 TtCHI 靶标基因功能区域片段

M.Marker DL 2 000; 1～2.pMD18-AK-CHIvector的PCR产物PCR products of pMD18-AK-CHIvector

图6 pMD18-AK-CHI载体的PCR验证

Fig.6 PCR identification of pMD18-AK-CHIvector

M.Marker Ⅲ; 1.Hind Ⅲ 与SacⅠ双酶切 pMD18-AK-CHI载体Fusion fragment PCR of pMD18-AK-CHIdigested byHind Ⅲ andSacⅠ; 2.Hind Ⅲ 酶切 pMD18-AK-CHI载体Fusion fragment PCR of pMD18-AK-CHIdigested byHinⅢ; 3.SacⅠ酶切 pMD18-AK-CHI载体Fusion fragment PCR of pMD18-AK-CHIdigested bySacⅠ

图7pMD18-AK-CHIvector载体的酶切验证

Fig.7Restriction enzyme analysis of

pMD18-AK-CHIvector

M.Marker DL 2 000; 1～5.pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHI的PCR产物PCR products of pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHIvector

图8pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHI载体的PCR验证

Fig.8PCR identification of pB7GWIWG2

(Ⅱ)-AK-CHIvector

双酶切和XbaⅠ酶切验证(图9)，获得具有Spec抗性的RNAi载体pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHI载体。将构建好的RNAi载体通过电击转化法导入到根瘤农杆菌菌株AgrobacteriumtumefaciensLBA4404。经PCR鉴定，结果表明已成功将pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHI质粒转化到LBA4404(图10)。可用作于植物的遗传转化研究。

M.Trans5K DNA Marker; 1.XbalⅠ与SacⅠ双酶切 pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHI载体Fusion fragment PCR of pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHIdigested byXbal Ⅰ andSacⅠ ;2.XbalⅠ 酶切pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHI载体Fusion fragment PCR of pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHIdigested byXbalⅠ

图9pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHI载体的酶切验证

Fig.9Restriction enzyme analysis

of pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHI

M.Marker DL 2 000; 1～5.pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHI载体的PCR扩增产物PCR products of pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHIvector

图10 pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHI

载体导入农杆菌的PCR验证

Fig.10PCR identification of pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-

CHIvector fromA.tumefaciens

3讨论与结论

新疆由于特有的荒漠绿洲灌溉农业，已成为中国重要的棉花生产基地。近些年，随着新疆棉花滴灌面积不断扩大，棉田小生境和农田生态环境也在逐渐发生改变，致使近几年螨害连年爆发，成为制约新疆棉花高产优质的重要因子[16]。有数据显示，中国的二斑叶螨、朱砂叶螨已对多种的农药产生抗性[17-18]。长期以来，中国农林作物害螨的防治一直以化学防治为主。化学农药的广泛使用，一方面杀伤大量天敌,使次要害虫上升为主要害虫和某些害虫的再猖獗，另一方面导致害螨的抗药性不断增强，迫使农药使用剂量增加或使用高毒农药，严重污染自然环境，物种多样性急剧减少，使生态系统变得十分脆弱，最终导致恶性循环。

自利用转基因植物介导的RNAi抑制棉铃虫、玉米根虫等危害取得成功以来，利用RNAi 控制害虫迅速成为国际研究热点[2-7]。RNAi 防治害虫的效率依赖于高效的干扰片断和简便的导入方法。在昆虫中，那些编码重要蛋白的功能基因是RNAi 很好的靶标。本研究选择棉叶螨的生长发育中2个关键酶基因精氨酸激酶基因TtAK与几丁质酶基因TtCHI，通过标准的DNA重组技术构建这2个靶标基因的融合片段；进而利用Gateway技术，依据DNA重组与λ噬菌体位点的特异性重组原理，通过BP和LR两步反应成功得获得植物干扰载体pB7GWIWG2(II)-AK-CHI，为进一步遗传转化棉花，改良棉花对棉叶螨的抗性奠定基础。

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Construction of RNAi for Synchronously Inhibiting Genes Vector ofTtAK

Received 2015-03-27Returned2015-04-27

Foundation itemNational Natural Science Foundation of China (No.31201521).

First authorGENG Wenchao,male,master student.Research area:seed biology and germplasm enhancement.E-mail:562517871@qq.com

(责任编辑：史亚歌Responsible editor:SHI Yage)

andTtCHIGenes Expression inTetranychusturkestani

GENG Wenchao,ZHAO Yiying,LIU Feng,WANG Xiaodong,LI Yanjun and SUN Jie

(College of Agriculture,Shihezi University,Shihezi Xinjiang832000,China)

AbstractIt’s necessary to produce transgenic plants which express the transcript of a double-stranded RNA (dsRNA) of Tetranychus turkestani AK and CHI gene for the purpose of improving plant resistance to cotton spider mites.The 453 bp and 610 bp fragments of dual-target gene TtAK and TtCHI were respectively amplified by PCR technology in this study firstly.Combining DNA recombinant technique with Gateway technology,the dual-target gene silencing RNAi vector pB7GWIWG2(Ⅱ)-AK-CHI based on RNAi vector pB7GWIWG2(Ⅱ) was successfully constructed.The study has laid the foundation for genetic transformation of cotton and improving plant resistance to cotton spider mites.

Key wordsTtAK gene; TtCHI gene; Gateway technology; RNA interference;Vector construction

收稿日期：2015-03-27修回日期：2015-04-27

基金项目：国家自然科学基金(31201521)。

通信作者：刘峰，男，副教授，研究方向为作物遗传育种与分子生物学。E-mail:liufeng@shzu.edu.cn

中图分类号Q966

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)04-0554-07

Corresponding authorLIU Feng,male,associate professor.Research area:crop genetics breeding and molecular biology.E-mail:liufeng@shzu.edu.cn

网络出版日期：2016-04-02

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1117.022.html

第一作者：耿文超，男，硕士研究生，研究方向为种子生物学与种质创新。E-mail:562517871@qq.com