食用菌液态发酵产酶特性及其对豆渣中膳食纤维含量的影响

赵哲，杨润强，顾振新

(南京农业大学 食品科技学院，江苏 南京，210095)



食用菌液态发酵产酶特性及其对豆渣中膳食纤维含量的影响

赵哲，杨润强，顾振新*

(南京农业大学 食品科技学院，江苏 南京，210095)

摘要研究了杏鲍菇(韩杏1号)、平菇(天达630)、香菇(香菇939)、珍珠菇(球香菇)和秀珍菇(夏丰1号)液态发酵产酶及其对豆渣中膳食纤维含量变化的影响。结果表明，这5种食用菌在豆渣液体培养基中生长8 d后，其生长和产酶特性差异显著，其中平菇生长快、蛋白质利用率高，同时具有较高的C1酶(外切葡聚糖酶)活性和较低的Cx酶(内切葡聚糖酶)及βG酶(β-葡萄糖苷酶)活性，发酵后培养基中可溶性膳食纤维(soluble dietary fibre,SDF)含量达到20.49%，是原料中SDF含量的4.39倍，显著高于其余4种食用菌。

关键词食用菌；液态发酵；豆渣；膳食纤维

在制作豆制品时产生的豆渣中，干物质含量占大豆质量的16%～25%[1]，我国每年有2 000多万吨湿豆渣排放[2]。豆渣富含膳食纤维、蛋白质、脂肪、维生素及黄酮等物质。膳食纤维(dietary fibre, DF)中的可溶性膳食纤维(soluble dietary fibre, SDF)和不可溶性膳食纤维(insoluble dietary fibre, IDF)对人体的生理作用不同[3]。SDF具有防止胆结石、排除体内有害金属离子、防止糖尿病、降低血清及胆固醇、防止高血压和心脏病等作用[4]，IDF则对肥胖症、便秘、肠癌等有效[5]。因此，SDF在DF中的比例影响生理作用。豆渣DF含量为50%～55%，其中SDF含量约为6%[6]。Richard和Donald建议平衡的DF组成要求SDF占DF总量的10%以上[7]。目前已利用生物发酵法获得苹果渣膳食纤维[8]和藕渣膳食纤维[9]等。

平菇、香菇、杏鲍菇、秀珍菇等食用菌在我国广为栽培，其生物学特性与栽培技术已有大量报道[10]，而产酶特性鲜见报道。食用真菌在生长过程中会生产复杂的酶系，其中包括蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶(内切葡聚糖酶(纤维素Cx酶)、外切葡聚糖酶(纤维素C1酶)和β-葡萄糖苷酶(βG酶))。在以上多种酶的协同作用下，豆渣蛋白和淀粉被逐步利用，纤维素被释放出来，同时IDF被纤维素酶水解为SDF和纤维二糖。

本文利用杏鲍菇、平菇、香菇、珍珠菇和秀珍菇等常见食用菌对豆渣进行发酵，探讨发酵过程中这五种食用菌关键酶活性、发酵液中主要成分以及经发酵后膳食纤维含量变化，旨在为食用菌发酵豆渣制备膳食纤维提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种

杏鲍菇(Pleurotuseryngii，韩杏1号)、平菇(Pleurotusostreatus，天达630)、香菇(Lentinusedodes，香菇939)、珍珠菇(Flammulinavelutiper，球香菇)、秀珍菇(Pleurotusgeesteranus，夏丰1号)均购自南京市高淳区食用菌研究所。

1.1.2原料

新鲜豆渣(由苏州金记食品有限公司提供)于50 ℃烘干后粉碎，过50目筛。

1.1.3培养基

斜面及平板培养基：采用PDA培养基(马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15 g/L，自然pH)。

种子培养基：采用PD液体培养液(马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH)。

豆渣培养基(发酵培养基)：新鲜豆渣沥水后于50 ℃烘干打粉，加水配置30g/L的料液，经胶体磨5 000 r/min条件下匀浆处理5 min获得豆渣培养基，自然pH。

豆渣固体培养基：豆渣培养基添加1.5%琼脂，灌注于平皿。

培养基采用湿热灭菌法灭菌，在121℃下灭菌20 min。

1.1.4试剂

牛血清白蛋白，美国sigma公司；羧甲基纤维素钠、D-水杨苷、葡萄糖、可溶性淀粉，上海国药集团化学试剂有限公司；酸水解酪蛋白，上海楷洋生物技术有限公司；无水乙醇，广东光华科技股份有限公司。

1.1.5仪器与设备

UV 5100B型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；HH-S2数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；JA2003电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司；PHSJ-5型实验室pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2实验方法

1.2.1发酵种子液的制备

将菌种接种至装有PDA培养基平板中央，于25℃培养12 d；用直径8 mm打孔器取4片菌丝体接种于装有50 mL PD培养基的250 mL三角瓶中，于25℃条件下120 r/min旋转振荡培养8 d，培养液在无菌条件下匀浆处理即得发酵种子液。

1.2.2液态发酵

将发酵种子液以10%(v/v)的接种量接种至装有50 mL豆渣培养基的250 mL三角瓶中，于25℃下80 r/min旋转振荡培养8 d，各菌种均设3个重复。

1.2.3生长速度测定

将菌种分别接种至装有PDA培养基和豆渣固体培养基平板中央，于25 ℃培养8 d；用游标卡尺测量菌落直径，计算平均生长速度(mm/d)。

1.2.4酶活性测定

粗酶液制备：发酵液于4 ℃、10 000 r/min冷冻离心15 min，上清液即为粗酶液。

淀粉酶活性测定参照文献[11]；蛋白酶活性测定参照文献[12]；纤维素C1酶活性测定参照文献[13]；纤维素C酶活性测定参照文献[14]；纤维素βG酶活性测定参照文献[15]。

1.2.5膳食纤维含量测定

豆渣原料直接取样，发酵样品于10 000 r/min离心后获得发酵上清液和发酵残渣，其中SDF由上清液中SDF和发酵残渣SDF中组成。

IDF及SDF：参照谢碧霞等[16]方法，以上均以干基计。

膳食纤维分IDF及SDF按式(1)计算百分含量。

(1)

1.2.6其他指标测定

水分含量：直接干燥法(GB 50093—2010)；淀粉含量：酸水解法(GB/T 5009.9—2008)；还原糖含量：3,5-二硝基水杨酸法[17]；粗蛋白含量：微量凯氏定氮法(GB 5009.5—2010)；粗脂肪含量：索氏抽提法(GB/T 5009.6—2003)；灰分：总灰分测定(GB 5009.4—2010)；pH测定：用pH测试仪测定。

1.2.7数据统计与分析

实验设3次重复，采用SAS 9.2统计软件进行分析。结果数据用均数±标准差(x±s)表示，不同组之间差异性采用one-way ANOVA方法进行比较，P<0.05表示差异显著。

2结果与分析

2.1豆渣中主要成分

如表1所示，豆渣中IDF含量最高，其次是蛋白质和脂肪，矿物元素含量较丰富，淀粉含量最少。研究表明豆渣中营养成分均衡，其碳源、氮源和矿质元素适宜微生物生长[18]。

表1　豆渣主要化学成分含量

2.2菌体生长速度及其膳食纤维含量

由表2可见，杏鲍菇、平菇、香菇、珍珠菇和秀珍菇在豆渣培养基中生长良好。其中，杏鲍菇、香菇和珍珠菇在豆渣培养基中的生长速度大于PDA培养基中；平菇的生长速度最快，并且在豆渣培养基中生长速度与PDA培养基中无显著差异；而秀珍菇在豆渣培养基中生长速度小于PDA培养基。

表2　菌株在不同培养基中的生长速度

注：同列小写子母不同表示差异显著(P< 0.05)。

2.3发酵过程中酶活性变化

2.3.1淀粉酶活性

由表3可知，菌体在利用豆渣培养基发酵过程中体现出不同的淀粉酶活性。其中杏鲍菇和秀珍菇发酵生成淀粉酶活性最低，其最高点分别出现在发酵第2 天和第4 天；平菇、香菇在发酵过程中淀粉酶活性最高，分别于发酵第6 天和第8 天时达到最高。淀粉被水解生成单糖、二糖、三糖和短链糊精等被菌体利用。本研究旨在利用菌体发酵产生的酶水解DF以外物质，以提高DF的产量和品质。

表3　发酵过程中食用菌淀粉酶活性　单位：mU/mL

注：同列小写子母不同表示差异显著(P< 0.05)。

2.3.2蛋白酶活性

5种食用菌菌丝体在以豆渣为培养基生长时，生成的蛋白酶活性显著不同(表4)。其中以香菇产生蛋白酶的能力为最强；其次为杏鲍菇和珍珠菇；平菇和秀珍菇蛋白酶活性相对较低，其中平菇在发酵前期蛋白酶活性较高，而秀珍菇在发酵中后期蛋白酶活性较高，并保持相对稳定的状态。可见，5种食用菌均具有分解豆渣中蛋白质的能力。

表4　发酵过程中食用菌蛋白酶活性 　　单位：mU/mL

注：同列小写子母不同表示差异显著(P< 0.05)。

2.3.3纤维素C1酶活性

由表5可知，5种食用真菌生成纤维素C1酶的情况显著不同，并且C1酶活性峰值出现时间也大不相同。珍珠菇生成C1酶活性最大值出现在第2 天，随后逐渐下降；香菇生成C1酶在发酵第4天出现最大值，随后逐渐下降；杏鲍菇、平菇及秀珍菇生成C1酶活性随发酵时间逐渐升高，在第6天达到最大，随后呈下降趋势；其中，平菇在第2、4、6 天的C1酶活性均高于其它四种食用真菌(发酵第2天的珍珠菇除外)，第6天达到最大值；杏鲍菇生成C1酶活性次之；以秀珍菇生成C1酶活性为最低。

表5　发酵过程中食用菌纤维素C1酶活性 　单位：mU/mL

注：同列小写子母不同表示差异显著(P< 0.05)。

2.3.4纤维素Cx酶活性

纤维素Cx酶也被称为内切葡聚糖酶，主要作用于纤维素的末端，随机水解纤维素生成纤维二糖。5种食用真菌生成纤维素Cx酶的活性差异显著(表6)。香菇、珍珠菇和秀珍菇生成纤维素Cx酶活性较低，其中秀珍菇最低；杏鲍菇和平菇生成纤维素Cx酶活性较高，又以杏鲍菇最高，其次是平菇。两种菌的纤维素Cx酶活性均先随发酵时间的延长而升高，发酵后期逐渐下降。

表6　发酵过程中食用菌纤维素Cx酶活性 　单位：mU/mL

注：同列小写子母不同表示差异显著(P< 0.05)。

2.3.5纤维素βG酶活性

纤维素βG酶又被称为β-葡萄糖苷酶，其主要作用是将纤维二糖水解为葡萄糖。五种食用真菌生成纤维素βG酶的活性差异显著，但各食用真菌的纤维素βG酶随发酵时间延长的变化趋势极其相似(表7)。可见，香菇和珍珠菇的纤维素βG酶较高，又以珍珠菇最高；杏鲍菇、平菇和秀珍菇纤维素βG酶活性较低。

表7　发酵过程中食用菌纤维素βG酶活性　单位：mU/mL

注：同列小写子母不同表示差异显著(P< 0.05)。

2.4发酵过程中主要成分变化

2.4.1可溶性蛋白含量变化

大豆中蛋白质含量高达35 g/100 g，加工后的豆渣中蛋白质含量仍高达17.28 g/100 g(见表1)，其中部分为可溶性蛋白。在食用真菌发酵作用下，蛋白质被水解为多肽、氨基酸等供菌体生长利用。五种食用真菌在发酵过程中培养基中可溶性蛋白质含量变化存在显著差异(图1)。香菇及珍珠菇对可溶性蛋白质利用能力最强，经发酵后培养基中可溶性蛋白含量最低；杏鲍菇和平菇次之；秀珍菇最弱。蛋白质作为主要氮源被真菌利用有利于菌丝体生长，并且蛋白质水解有利于提高膳食纤维品质。

图1　发酵过程中可溶性蛋白含量变化Fig.1　Change of soluble protein content during fermentation

2.4.2游离氨基酸含量变化

培养基中的游离氨基酸主要来源于豆渣蛋白质水解，其含量处于蛋白水解生成和被微生物利用的动态变化中(图2)。发酵初期，在菌体蛋白酶作用下氨基酸开始生成，含量显著增加；随着菌体的快速生长，游离氨基酸被菌体利用，其含量趋于平缓；其中，以平菇发酵第4天游离氨基酸含量最高，香菇最低；发酵结束后，游离氨基酸含量由高至低依次为：平菇、秀珍菇和珍珠菇、香菇及杏鲍菇。

图2　发酵过程中游离氨基酸含量变化Fig. 2　Change of free amino acids content during fermentation

2.4.3还原糖含量变化

培养基中的还原糖主要来源于豆渣中纤维素，同样处于水解生成和被微生物利用的动态变化中(图3)。随着菌丝体的生长，还原糖开始生成，其中，珍珠菇在发酵第2～6 天水解生成大量还原糖，第6 天达到最大值；香菇、平菇和杏鲍菇发酵过程中还原糖含量呈现缓慢增加趋势；秀珍菇在发酵初期还原糖增加，2 天后开始下降并趋于平缓；发酵结束后，还原糖含量由高至低依次为：珍珠菇、香菇、平菇、杏鲍菇和秀珍菇。

图3　发酵过程中还原糖含量变化Fig.3　Change of reducing sugar content during fermentation

2.5发酵后膳食纤维含量

如表8所示，经食用菌发酵后的豆渣培养基中膳食纤维含量发生显著变化。其中IDF含量经发酵后都显著低于未发酵样品(IDF含量为45.50 g/100 g，见表1)，SDF含量均显著高于未发酵豆渣(SDF含量为4.67 g/100 g，见表1)。其中，以平菇发酵后培养基中SDF含量最高，为豆渣原料中的4.39倍。食用菌生长过程中会生成复杂的纤维素酶系包括纤维素C1酶、Cx酶、βG酶等，在这些酶的作用下，IDF被分解利用，生成单糖、寡糖等小分子糖类供菌体生长所需，在该过程中SDF含量有所增加；并且单糖等小分子糖类被微生物利用后同样会生产菌体多糖，进一步提高了SDF的含量。

表8　发酵后膳食纤维含量

3讨论

食用菌生长过程中会产生复杂的酶系统，包括淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等，用以降解淀粉、蛋白质和纤维素等营养物质，为自身生长等生理活动提供底物。周健等[19]研究得出，灵芝等4种食用菌瓶在以玉米粉、黄豆粉为主要原料的培养基中摇瓶培养5～10 d后，培养基中总糖含量降低，还原糖呈现先上升后降低趋势，游离氨基酸含量升高，同时菌丝干重呈现上升趋势。随着菌丝生长，培养基中淀粉、蛋白质等主要营养物质被菌体产生的酶系统水解，供自身生长所需。本实验结果表明，平菇等食用菌发酵过程中，培养基中可溶性蛋白含量呈下降趋势、游离氨基酸及还原糖含量呈上升趋势，且差异显著。庄庆利等[20]对三个平菇品种培养过程中胞外酶活性变化进行了研究，结果表明，平菇培养过程中羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶、淀粉酶等胞外酶活性与菌丝体生长速度具有显著正相关，与其他研究者对姬松茸(Agaricusblazei)、金顶侧耳(Pleurotuscitrinopileatus)、香菇(Lentinusedodes)等食用菌的胞外酶活性研究结果相似[21]。

食用菌生长过程中最关键的酶系统为纤维素酶系。普遍认为，纤维素转化为葡萄糖是纤维素酶各组分协同作用的结果。关于纤维素酶各组分之间的协同作用，一种观点认为，首先由C酶在纤维素分子内部的无定形区进行酶切产生新的末端，然后由C1酶以纤维二糖为单位由末端进行水解，每次切下1 个纤维二糖分子，最后由βG酶将纤维二糖以及短链的纤维寡糖水解为葡萄糖；另一种观点则认为，首先是由C1酶水解不溶性纤维素生成可溶性的纤维糊精和纤维二糖，然后由C酶作用于纤维糊精生成纤维二糖，再由βG酶将纤维二糖分解成2个葡萄糖[22]。这种协同作用方式也决定了纤维素酶表达调控的复杂性。掌握纤维素酶各组分间协同作用机理对于菌种筛选具有指导性的意义。

4结论

豆渣经杏鲍菇、平菇、香菇、珍珠菇和秀珍菇液态发酵后，DF均得到一定程度的水解，SDF含量提高，其中，以平菇发酵后培养基中SDF含量最高，香菇和秀珍菇次于平菇，这与发酵过程中平菇具有较高的C1酶活性和较低的C酶及βG酶活性有关。因此，平菇是豆渣DF改性的理想食用真菌。

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Enzymes produced by liquid state fermentation of edible fungi and their effects on the main nutrients of soybean okara

ZHAO Zhe，YANG Run-qiang，GU Zhen-xin*

(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China)

ABSTRACTThe enzymes produced by liquid state fermentation of edible fungi and their effects on the main nutrients of soybean okara were studied. Results showed that there were statistically significant differences in the growth speeds and enzyme properties among different edible fungis. Pleurotus ostreatus had fast growth rate and high protein availability, as well as higher activity of exo-1,4-β-D- glucanase, lower activity of endo-1,4-β-D- glucanase and β -1, 4-D-glucosidase. The content of SDF reached 20.49%, which was 4.39 times higher than that in soybean okara and significantly higher than those from the other four kinds of edible fungis.

Key wordsedible fungi; liquid state fermentation; soybean okara; dietary fibre

收稿日期：2015-09-25，改回日期：2015-11-09

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602019

第一作者：硕士研究生(顾振新教授为通讯作者，E-mail:guzx@njau.edu.cn)。