浆膜腔积液细胞块全切片扫描图像作为初始诊断的可行性研究

李媛媛，钟 琴，胡佐鸿

(成都市第一人民医院病理科，四川 成都 610041)

浆膜腔积液细胞块全切片扫描图像作为初始诊断的可行性研究

李媛媛，钟 琴，胡佐鸿

(成都市第一人民医院病理科，四川 成都 610041)

目的 探讨全切片扫描图像技术在浆膜腔积液细胞块初始诊断中的可行性。方法 回顾成都市第一人民医院病理科2015年1～12月318例浆膜腔积液细胞块病理资料，采用优纳第四代全自动数字切片扫描系统扫描玻片，存入电脑。所有玻片均由同一位病理主治医生独立重新阅片分析。观察者先进行原始玻片传统光学显微镜判读，5周后再于电脑上判读数字切片。阅片结束后，计算分析光学显微镜上判读与电脑数字切片判读的的可重复性。结果 全切片扫描图像诊断与传统光学显微镜诊断的，Kappa值0.91。所有的诊断差异性出现在可疑肿瘤病例，在良性与恶性病例之间没有诊断差异性。结论 数字切片扫描图像技术可用于细胞块初始诊断。

全切片扫描图像；传统光学显微镜；数字切片；浆膜腔积液；细胞块

数字切片扫描与应用系统通过全自动显微镜扫描平台，扫描与控制软件系统，集光学、自动化、计算机与图像处理、网络等技术，将传统的玻璃切片进行扫描和无缝拼接，生成包括传统玻璃切片内所有信息，即一整张全视野高分辨率的数字化切片(whole slide imaging，WSI)，也称虚拟病理切片(virtual slide of pathology)。数字切片技术经过二十余年的发展完善，已有多项不同的病理实践，目前国内的应用主要包括：病理质量控制[1]、远程病理会诊[2，3]、病理科研教学[4，5]、病理切片存档、病理读片等[6]，均取得了很大的进展。但是，全切片扫描图像技术作为病理科常规一线病理诊断应用还不多。随着WSI技术的日益成熟，高分辨率数字图像的获得，把WSI作为常规应用的时机已经成熟。但在临床病理一线诊断实践之前，WSI的这一应用的有效性需要得到证实，这便需要比较同一病理图像在WSI与传统光学显微镜(conventional microscopy，CM)之间观察者内的可重复性。按照美国病理家学会(College of American Pathologist，CAP)关于WSI用于病理诊断目的验证指南[7]，这一比较应在所有临床面对的病理诊断实践中实施，包括石蜡切片、冰冻切片、免疫组化、细胞学等。本文比较了在浆膜腔积液细胞块切片中，同一观察者在WSI与CM之间的诊断重复性。本文将成都市第一人民医院病理科2015年的细胞块HE扫描图像的判读与光学显微镜下的判读结果比较，以探讨全切片扫描图像技术在浆膜腔积液细胞块诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集成都市第一人民医院病理科2015年1～12月的浆膜腔积液细胞块病理资料共318例，年龄7～93岁，平均年龄65岁。男209例，女109例。其中，胸水细胞块242 例，腹水细胞块62例，心包积液细胞块14例。318例细胞块切片中，原始诊断恶性肿瘤共90例，其中腺癌共82例，小细胞癌3例，鳞癌3例，间皮瘤1例，淋巴瘤1例；可疑恶性70例；未见恶性病变共158例。

1.2 方法 细胞块制作标本离心后甲醛固定，酒精脱水，再离心取沉渣，石蜡包埋切片，HE染色。玻片扫描采用北京优纳科技有限公司PRECICE600×8全自动数字切片扫描系统扫描不同切片，快速线性扫描玻片，40倍扫描，可一次性扫描240张(用时约23个小时)，共扫描318张。所有玻片均由同一位病理主治医生独立重新阅片分析。WSI浏览阅片软件采用北京优纳科技有限公司PRECISE iViewer(软件版本5.2.10.0)，电脑显示器DELL U2312，分辨率1920×1080。

在第一阶段，观察者进行原始玻片光学显微镜判读，阅片结束5周后再于电脑上进行随机编号数字切片判读，为观察者提供每例细胞块切片的原始基本临床信息，隐藏细胞块切片原始诊断结果。判读结果参照Nathan细胞块四分类诊断[8]，简化分为恶性肿瘤(主要包括腺癌、小细胞癌、鳞癌、淋巴瘤、间皮瘤等)，可疑恶性肿瘤，未见恶性肿瘤三个大类。阅片结束后，计算分析第一次光学显微镜上判读与第二阶段电脑数字切片判读的可重复性。可重复分为三类：一致(两次诊断完全相同)、基本一致(恶性诊断为可疑恶性，或反之)、不一致(恶性或可疑恶性诊断为良性，或反之)。最后，计算重复性完全一致的百分比及95%的可信区间。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学处理。计算两次判读完全一致的百分比(95%的可信区间)。对观察者两次的判读结果一致性采用Kappa系数(κ值)判定。判定标准为：κ≤0.00时，无意义；κ=1时，表明2次观察结果完全一致；0.00<κ≤0.40时，表明2次观察一致性差；0.40<κ≤0.60时，表明两者一致性中度；0.60<κ≤0.80时，表明两者有较高的一致性；κ>0.80时，表明两者有极好的一致性。

2 结果

318例细胞块切片，有18例扫描不成功(15由于机器故障造成，3例由于切片质量原因)，实际纳入分析的细胞块切片共300例。第一次光镜阅片与第二次数字阅片结果可重复性比较见表1。

表1 光镜阅片CM与数字阅片WSI结果重复性比较 (n=300)

两次阅片完全一致的共284例，诊断Kappa值0.91。基本一致的7例，不一致的9例。所有的诊断不一致出现在可疑恶性病例，在良性与恶性病例之间没有诊断不一致。

3 讨论

3.1 细胞块及WSI的特点 在肿瘤的防治及诊断中，细胞病理学占有重要的地位。但是，相较与组织病理学，由于细胞学不具备组织结构特征，因此又存在显著的局限性。近年来逐渐开展的细胞块技术明显缩小了细胞学与组织学之间的差距，主要表现在：一方面，细胞块切片显示出了细胞团块的微小结构特征，接近微小组织活检；另一方面也是最重要的一面，细胞块切片可以进一步行免疫细胞化学染色[9]，在良恶性的鉴别及病理分型中发挥了举足轻重的作用。虽然细胞块的免疫细胞化学如此重要，但与组织学标本比较，受标本本身的特点及取材限制，细胞块一般较小，经细胞块切片及免疫细胞化学检测后，一般所剩不多。因此，细胞块切片的保存就相当重要。但是，随时间的流逝，染色会褪色或模糊，尤其是免疫细胞化学切片毁损或褪色后无法再生。因此，寻找细胞学玻片的良好保存方法势在必行。

WSI是近年出现的新技术[10，11]，由于能够对切片信息全数字化储存，永久保存，可能是一种很好的替代保存方式，不存在玻片损坏、丢失及褪色风险。数字切片阅读能够模拟光镜观察如在平面X轴-Y轴移动及放大观测倍数，数字切片阅读还能够提供另外的特点，如任何方向方便的图片移动导向，系统观察整张切片，避免漏掉局部区域，多张图片同时观察，同一切片的不同染色并列比较，连续变焦放大缩小，多人同时阅片讨论，这都更有利于图片观察(图1a)。在病理学医、教、研实践中，数字切片具有传统切片的所有功能，借助网络具有阅片不受空间与时间限制的优点。

3.2 细胞块应用于WSI的优势 WSI用于能否用于细胞块初始诊断，还需要病理实践印证，其前提是全切片扫描图像的判读要与CM下的判读具有可重复性。关于这类可重复性研究在组织病理学诊断中近来有较多报道，包括常规外科病理[12]及胃肠[13]、泌尿[14]、乳腺[15]、前列腺[16]专科组织系统。与组织学研究相比，细胞学的WSI研究不多，而且，细胞学涂片的独自特点如涂片厚薄不均，重叠，背景模糊是对数字化切片的挑战，而这类问题在日常光镜下通过上下调焦观察不同平面是容易得到解决的。虽然3D多平面扫描技术也即WSI的Z轴堆叠扫描(Z-stacking)也可以解决上述细胞学涂片的问题，但成本高，扫描耗时长，操作麻烦，并不利于细胞学WSI的开展。然而，与组织学切片一样，细胞块切片能够避免上述细胞涂片问题，这也是细胞块技术优于传统涂片的特点之一。因此，依靠细胞块技术，细胞学可以有效地与WSI联姻。

图1 浆膜腔积液细胞块不同病理改变WSI浏览显示器界面截图(右上方为缩略图) a.细胞块切片外观，包括切片编号及细胞块形态;b.良性病变,可见间皮细胞、淋巴细胞及中性粒细胞(×40);c.腺癌,核仁明显，核膜增厚，可见腺体结构(×40);d.鳞癌,细胞成巢，核仁明显(经免疫细胞化学证实,×40);e.小细胞癌,细胞胞质稀少，镶嵌状排列明显(经免疫细胞化学证实,×40);f.可疑腺癌,细胞形态温和，可见腺样结构(最后经免疫细胞化学证实为间皮瘤,×20)

细胞块的WSI研究有少量报道[17，18]，Tawfik报道了妇科液基剩余标本细胞块的WSI研究，证实液基细胞块WSI是可行的一种选择，能够有效发现宫颈微生物及良性反应性改变；并与原始液基细胞学结果比较，证实妇科液基细胞块WSI发现异常细胞的敏感性与液基涂片一致，并显示出检出LSIL与HSIL更高的特异性。关于非妇科的体液细胞块的WSI研究尚未见报道。在本研究中，我们发现细胞块切片的WSI能够完全再现在光镜下的细胞学特征，明确显示胸水、腹水、心包积液中的良性细胞如间皮心包、淋巴细胞及中性粒细胞等(图1b)；能够发现恶性肿瘤细胞如腺癌(图1c)、鳞癌(图1d)、小细胞癌(图1e)；可以观察到腺癌的核仁、腺腔，鳞癌的角化，小细胞癌的粉尘染色质、镶嵌排列等细微特征。

3.3 细胞块WSI与CM阅片的可重复性 在本研究中，两次阅片完全一致的共284例，诊断κ=0.91。所有的诊断基本一致及不一致都与可疑恶性病例相关，在良性与恶性病例之间没有诊断不一致。本研究95%可重复性与其他学者报道的可重复性基本一致，Houghton在普外科病理报道的重复性为95%[12]，Janabi在胃肠[13]、泌尿[14]、乳腺[15]等专科领域报道的可重复性分别为95%、87%、93%。

基本一致的7例中，4例WSI诊断为可疑恶性，而CM诊断为恶性；3例WSI诊断为恶性，而CM诊断为可疑恶性。重新回顾这7例，发现其共同特征是异型性细胞恶性特征明确，但是数量少，诊断者在作出恶性或可疑恶性的尺度把握上重复性不好造成的，并非WSI本身的缺陷造成。这类轻度的不一致也不具有明显的临床及预后意义，对待可疑恶性，我们一般通过再次送检标本或在细胞块切片上做免疫细胞化学检测都能够最终明确诊断(图1f)。

不一致的9例中，3例WSI诊断为未见恶性，而CM诊断为可疑恶性；6例WSI诊断为可疑恶性，而CM诊断为未见恶性。重新回顾这9例，发现其共同特征是异型性细胞恶性特征模棱两可，即我们常说的核异质细胞，诊断者在做出良性或可疑恶性的尺度把握上重复性不好造成的，也并非WSI本身的缺陷造成。这类不一致其实在诊断者两次光镜下不同时段诊断也可能出现，即诊断者内的可重复性变异，Reyes等[19]在WSI与CM的可重复性研究中，比较了诊断者内两次不同时段CM阅片的可重复性变异性，发现三位不同病理学者的可重复性变异分别为4%、7%、0%，平均3.7%。

综上所述，我们的研究显示WSI可较好地用于细胞块初始诊断。

[1] 邓学田.数字化病理技术在病理学实验室中的应用[J].河北医科大学学报，2014，35(3)：370-372.

[2] 祁真玉等.远程病理会诊的实际应用与体会[J].诊断病理学杂志，2012，19(5)：392.

[3] 于晓东，梁利斌，唐应成，等.病理远程会诊在基层病理科的应用分析[J].重庆医学，2013，42(21)：2521-2523.

[4] 吕福东，孔贺利.数字切片优势及在病理教学应用[J].中国医药科学，2013，3(23)：160-161，185.

[5] 张真真，张声，陈林莺，等.数字化涂片在细胞病理实验教学中的应用与评估[J].临床与实验病理学杂志，2012，28(7)：816-819.

[6] 叶美华，盛弘强，王怡栋，等.数字病理切片系统可视化数据应用简介[J].中华病理杂志，2012，4(1)：66-68.

[7] Pantanowitz L，Sinard JH，Henricks WH，et al.Validating whole slide imaging for diagnostic purposes in pathology：guideline from the College of American Pathologists Pathology and Laboratory Quality Center [J].Arch Pathol Lab Med，2013，137(12)：1710-1722.

[8] Nathan NA，Narayan E，Smith MM，et al.Cell Block cytology improved preparation and its efficacy in diagnostic cytology [J].Am J Clin Pathol，2000，114(4)：599-606.

[9] 肖坚.联合检测Epithelial Antigen、E-cadherin、CEA、TTF-1、CK5/6和Calretinin对胸腔积液中腺癌和间皮细胞的鉴别诊断价值[J].实用医院临床杂志，2011，8(4)：91-93.

[10]Cornish TC，Swapp RE，Kaplan KJ.Whole-slide imaging：routine pathologic diagnosis[J].Adv Anat Pathol，2012，19(3)：152-159.

[11]El-Gabry EA，Parwani AV，Pantanowitz L.Whole-slide imaging：Whole-slide imaging：widening the scope of cytopathology.[J].Diagn HistoPathol，2014，20(12)：456-461.

[12]Houghton JP，Ervine AJ，Kenny SL，et al.Concordance between digital pathology and light microscopy in general surgical pathology：a pilot study of 100 cases[J].J Clin pathol，2014，67(12)：1052-1055.

[13]Al-Janabi S，Huisman A，Vink A，et al.Whole slide images for primary diagnostics of gastrointestinal tract pathology：a feasibility study[J].Hum pathol，2012，43(5)：702-707.

[14]Al-Janabi S，Huisman A，Jonges GN，et al.Whole slide images for primary diagnostics of urinary system pathology：a feasibility study[J].J Renal Inj Prev，2014； 3(4)：91-96.

[15]Al-Janabi S，Huisman A，Willems SM，et al.Digital slide images for primary diagnostics in breast pathology：a feasibility study.[J].Hum pathol，2012，43(12)：2318-2325.

[16]Rodriguez-Urrego PA，Cronin AM，Al-Ahmadie HA，et al.Interobserver and intraobserver reproducibility in digital and routine microscopic assessment of prostate needle biopsies[J].Hum pathol，2011，42(1)：68-74.

[17]Tawfik O，Davis M，Dillon S，et al.Whole-slide imaging of Pap cellblock preparations is a potentially valid screening method [J].Acta Cytol，2015，59(2)：187-200.

[18]Tawfik O，Davis M，Dillon S，et al.Whole slide imaging of Pap cell block preparations versus liquid based thin layer cervical cytology：A comparative study evaluating the detection of organisms and nonneoplastic findings.[J].Acta Cytol，2014，58(4)：388-397.

[19]Reyes C，Ikpatt OF，Nadji M，et al.Intra-observer reproducibility of whole slide imaging for the primary diagnosis of breast needle biopsies [J].J Pathol Inform，2014，5：5.

Whole slide images of serous effusion cell blocks for the primary diagnosis：A feasibility study

LI Yuan-yuan，ZHONG Qin，HU Zuo-hong

(Department of Pathology，Chengdu First People’s Hospital，Chengdu 610041，China)

HUZuo-hong

Objective To investigate the feasibility of whole slide imaging (WSI) of serous effusion cell blocks for the primary diagnosis.Methods Serous effusion cell blocks from 318 cases between January 2015 and December 2015 at our department were retrospectively reviewed.Each slide was digitally scanned by UNIC fourth generation digital section scanning system and the images were stored in a shared file.All slices were independently reviewed by the same pathologists.The observers first reviewed the glass slides under conventional microscopy (CM) and then reviewed the digital images in an interval of 5 weeks.After finishing all cases，reproducibility of WSI versus CM were analyzed.Results The diagnostic reproducibility for WSI versus CM was 95% CI (0.93～0.97).κ= 0.91.All diagnostic disagreements were found in suspicious malignancy.There was no intra observer disagreement in the diagnosis of benign versus malignant diseases.Conclusion WSI could be used for the initial diagnosis of serous effusion cell blocks.

Whole slide imaging； Conventional microscopy； Digital slide；Serous effusion；Cell block

胡佐鸿

R361

A

1672-6170(2016)04-0089-04

2016-02-13；

2016-05-04)