猪Sirt5基因的克隆及其腺病毒载体的构建和鉴定

黄魁英，冯永达，明飞平，肖安吉，卢志鹏，楚品品，黄瀚威，谭家裕，夏枫耿，黄朝远，杨　军，蔡海明，马苗鹏，张玲华（.广州市微生物研究所，广东广州50663；.华南农业大学生命科学学院广东省农业生物蛋白质功能与调控重点实验室，广东广州5064）



猪Sirt5基因的克隆及其腺病毒载体的构建和鉴定

黄魁英1，冯永达2，明飞平1，肖安吉2，卢志鹏2，楚品品2，黄瀚威2，谭家裕2，夏枫耿1，黄朝远2，杨军2，蔡海明2，马苗鹏2，张玲华2
（1.广州市微生物研究所，广东广州510663；2.华南农业大学生命科学学院广东省农业生物蛋白质功能与调控重点实验室，广东广州510642）

摘要：为了从猪脑中克隆得到Sirt5基因，并构建腺病毒载体，提取长白猪脑组织总RNA，利用RT-PCR和PCR扩增得到Sirt5基因。再将此基因克隆至穿梭载体上，构建重组腺病毒的穿梭质粒pShuttle-IRES-Sirt5。经酶切线性化，电击转化已含骨架载体pAdEasy-1DNA的BJ5183+感受态菌，得到重组腺病毒质粒Ad-Sirt5。重组腺病毒质粒经酶切线性化鉴定。结果本试验获得的Sirt5基因与NCBI公布序列一致。利用细菌同源重组技术构建重组腺病毒载体，经酶切鉴定正确。表明本试验成功克隆得到Sirt5基因，并成功构建Sirt5基因的腺病毒载体。

关键词：猪；Sirt5基因；重组；腺病毒

冯永达（1992-），男，本科，从事农业生物技术工作，E-mail：931671302@qq.com

注：冯永达与黄魁英对本文具有同等贡献

Sirtuins（Sirt）蛋白家族是一类与寿命调节、新陈代谢和疾病有关的重要蛋白。目前在哺乳动物中已发现至少7种Sirt基因（Sirt1～Sirt7）。其中，Sirt5是存在于线粒体中的一种NAD+依赖性去乙酰化酶，在脑、肝、心和肺等广泛表达［1］。Sirt5在新陈代谢方面具有重要作用，但具体机制并不是很清楚，随着研究的深入，Sirt5有望成为代谢疾病治疗的新靶点。

重组腺病毒具有宿主范围广，病毒粒子稳定性较好，有效感染细胞实现外源基因表达，可容纳较长外源DNA，且不整合到染色体中等优点，已被广泛应用于临床和生物治疗［2］。猪与人类在解剖学、遗传学和生理机能上极为相似，可作为研究各种人类医学方面的生物模型。目前，猪已被广泛用于免疫机理研究、心血管系统和消化系统等器官移植研究［3］。与此同时，在研究Sirt5分子控制细胞生理功能上，猪也是一种理想的模型。因此本实验试图获取猪Sirt5基因，并构建过表达腺病毒载体，为进一步研究基因在细胞增殖分化中的作用奠定基础。

1　材料与方法

1.1主要材料载体pShuttle-IRES-hrGFP-2和含pAdEasy-1 DNA的BJ5183+感受态，购自美国Stratagene公司；DH5α感受态菌株及HEK293细胞株为本实验室保存。

1.2Sirt5基因克隆取备好的组织于液氮中研磨，TRIZol法提取总RNA，经RT-PCR反应合成cDNA。根据猪Sirt5基因序列（GenBank：NM_ 001105

308），设计引物，上游（Sirt5-F-1）：AACCTGATGCCACCTCTCTGG；下游（Sirt5-R-1）：CGGGACGACTAAGAGACAGGTT，进行PCR扩增，产物长度为947 bp。将扩增产物连入T-vector，构建T-Sirt5质粒，转化DH5α感受态细菌，进行PCR鉴定。

1.3Sirt5穿梭载体及重组腺病毒载体的构建及鉴定用带有EcoR V和Xho I酶切位点的引物：上游（Sirt5-F-2）：GATATCCCACCATGCCACCTCTCTG；下游（Sirt5-R-2）：CCGCTCGAGCTAAGAGACAGGTTCA，以T-Sirt5质粒为模板，进行PCR扩增，产物长度为956 bp。扩增产物与pShuttle-IRES-hrGFP-2连接，获重组质粒pShuttle-IRESSirt5，用EcoR V和Xho I双酶切进行鉴定。pShuttle-IRES-Sirt5经EcoR I线性化，转化含pAdEasy-1 DNA的感受态菌BJ5183+进行同源重组，获重组质粒Ad-Sirt5，用Pac I酶进行酶切鉴定。

1.4重组腺病毒的包装扩增Ad-Sirt5经PacⅠ酶切线性化，在Lipofectamine2000介导下转染HEK293细胞（细胞融合至70%～80%），转染后48 h观察绿色荧光蛋白的表达。

1.5RT-PCR检测Sirt5基因的表达收集转染后的HEK293细胞，抽提RNA，逆转录得到cDNA，根据猪Sirt5基因序列，设计RT-PCR引物，上游（Sirt5-F-3）：CAAGCACATAGTTGTCATT；下游（Sirt5-R-1）：TTCTCCAATAACCTCCTG，RT-PCR检测Sirt5基因的表达，目的产物长度86 bp。

2　结果及分析

2.1Sirt5全长基因的克隆以cDNA为模板，PCR扩增得到大小为947 bp的Sirt5基因，结果如图1所示。重组质粒T-Sirt5经测序结果正确。

图1　T- Sirt5的PCR鉴定M：DL-2 000 Marker；1：Sirt5基因PCR产物

2.2Sirt5重组腺病毒载体的构建重组质粒pShuttle-IRES-Sirt5经双酶切和PCR鉴定，结果正确，如图2A和B。Ad-Sirt5经PacⅠ酶切鉴定，可见1条3.5 kb的小片段，如图2C，结果正确。

图2　pShuttle- IRES- Sirt5阳性克隆鉴定A：双酶切鉴定；B：PCR鉴定；C：腺病毒载体Pac I酶切鉴定

2.3重组腺病毒的包装扩增及鉴定重组腺病毒转染HEK293细胞（60%～70%融合状态，如图3A）后，培养48 h，由图3B和3C可知，GFP在HEK293细胞中成功表达。

2.4Sirt5基因表达的检测提取转染后HEK293细胞总RNA，逆转录后RT-PCR检测Sirt5的表达，结果显示，含有Sirt5基因的重组腺病毒载体转染HEK293细胞扩增出了相应大小的基因片段，如图4，由此判断Sirt5基因能在HEK293细胞中成功转录出cDNA。

图3　转染细胞的显微观察A：转染前的HEK293细胞；B：可见光下的转染细胞；C：荧光激发下的转染细胞

图4　Sirt5重组腺病毒载体转染HEK293细胞后RT- PCR检测M：DL-2 000 Marker；1、2、3：Sirt5基因PCR产物

3　讨论

Sirtuins（Sirt）蛋白家族在哺乳动物细胞中主要有7个成员：Sirt1～Sirt7。目前有相当数量的文章报告显示，该家族在细胞和动物的生理机能、疾病治疗和寿命调控都具有重要作用［4-5］。Sirt1主要作用于FOXO家族和NF-kB，调节新陈代谢、炎症和寿命等；Sirt2作用于PAR3和微管蛋白等，参与细胞周期调节；Sirt3作用于AceCS2和GDH等，参与新陈代谢调节；Sirt4作用于GDH，促进胰岛素分泌；Sirt6作用于组蛋白H3K9和H5K56等，参与DNA修复；Sirt7作用于RNA聚合酶I，参与DNA转录［6］。但是对于Sirt5的研究和报道相对较少，主要报道发现，Sirt5能够调节氨甲酰基-磷酸合成酶（CPS1）促进尿素循环［7-8］，也能通过尿酸氧化酶调节嘌呤代谢［9］和促进赖氨酸去琥珀酰和丙二酰化实现能量代谢调控［10］。因此，寻找和建立有效的研究手段势必推动Sirt5更多研究价值的发现。

由于腺病毒载体具有各方面优势，已被广泛应用于临床实验中［11］，本试验将腺病毒穿梭质粒转化至含骨架质粒的重组菌种，构建Sirt5重组腺病毒载体，其转染HEK293细胞后，确定具有病毒感染效果。综上所述，本试验成功构建具有活性的腺病毒载体Ad-Sirt5，为后续Sirt5功能研究或疾病治疗等奠定基础。

参考文献：

［1］Ren Y，Shan T Z，Zhu L N，et al.Effect of breed on the expression of Sirtuins（Sirt1- 7）and antioxidant capacity in porcine brain［J］.Animal，2013，7（12）：1994-1998.

［2］Kay M A.State-of-the-art gene-based therapies：the road ahead ［J］.Nat Rev Genet，2011，12（5）：316-328.

［3］Swindle M M，Makin A，Herron A J，et al . Swine as models in biomedical research and toxicology testing［J］. Vet Pathol，2012，49（2）：344-356.

［4］Milne J C，Denu J M . The Sirtuin family：therapeutic targets to treat diseases of aging［J］. Curr Opin Chem Biol，2008，12（1）：11-17.

［5］Rardin M J，He W，Nishida Y，et al . SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks［J］. Cell Metab，2013，18（6）：920-933.

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［9］Nakamura Y，Ogura M，Ogura K，et al . SIRT5 deacetylates and activates urate oxidase in liver mitochondria of mice［J］. FEBS Lett，2012，586（23）：4076-4081.

［10］Park J，Chen Y，Tishkoff D X，et al.SIRT5-mediated lysine desuccinylation impacts diverse metabolic pathways［J］. Mol Cell，2013，50（6）：919-930.

［11］Callahan S M，Ming X，Lu S K，et al.Considerations for use of recombinant adenoviral vectors：dose effect on hepatic cytochromes P450［J］.J Pharmacol Exp Ther，2005，312（2）：492-501.

Amplification geneof swine Sirt5 and construction of its adenovirus vector

HUANG Kui-ying1，FENG Yong-da2，MING Fei-ping1，XIAO An-ji2，LU Zhi-peng2，CHU Pin-pin2，HUANG Han-wei2，TAN Jia-yu2，XIA Feng-geng1，HUANG Chao-yuan2，YANG Jun2，CAI Hai-ming2，MA Miao-peng2，ZHANG Ling-hua2
（1.Guangzhou Institute of Microbiology，Guangzhou 510663，China；2.College of Life Sciences of South China Agricultural University，Function and Regulation of Agricultural Biotechnology protein of Guangdong Province Key Laboratory，Guangzhou 510642，China）

Abstract：Porcine Sirt5 gene was cloned and constructed into an adenovirus vector.Total RNA was extracted from Landrace brain，and the Sirt5 gene was amplified by RT-PCR.Then the Sirt5 gene was cloned into pShuttle-IRES-hrGFP-2 shuttle vector to construct a recombinant adenovirus shuttle plasmid named pShuttle-IRES-Sirt5 . The recombinant shuttle plasmid was transformed into BJ5183+ competent bacteria contained pAdEasy-1 DNA backbone carrier by electroporation method to construct adenoviral plasmid Ad-Sirt5.The Sirt5 gene obtained in this study was indentical with the NCBI published sequence.The recombinant shuttle carrier was restructured into adenovirus vector by homologous recombination in bacteria and confirmed to be correct by restriction enzyme analysis.The Sirt5 gene was cloned and recombinant adenovirus expression vector was constructed successfully in this study.

Key words：porcine；Sirt5；reorganization；adenovirus

中图分类号：Q782

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）03- 0003- 03

收稿日期：2015-06-11

基金项目：广东省自然科学基金（2014A030313449）；广东省大学生创新训练项目（1056413052）；广州市科技惠民项目（2014Y2-00116）；广州市科学研究项目（201510010057）

作者简介：黄魁英（1982-），女，高级工程师，硕士，研究方向为兽医免疫学，E-mail：qiushuixian2014@163.com

通讯作者：张玲华，E-mail：lhzhang@scau.edu.cn

Corresponding author：ZHANG Ling-hua