发根农杆菌诱导草莓毛状根的研究

朱秀蕾， 李 萍

(安庆职业技术学院园林园艺系，安徽安庆 246003)

发根农杆菌诱导草莓毛状根的研究

朱秀蕾， 李 萍

(安庆职业技术学院园林园艺系，安徽安庆 246003)

摘要[目的]建立高效的发根农杆菌诱导草莓生根再生体系。[方法]以适合安徽省栽培的草莓优良品种丰香为试材，利用发根农杆菌R1601侵染植物细胞，观察发根农杆菌诱导草莓离体叶片产生毛状根的效果。[结果]发根农杆菌R1601培养成功；Carb有效除菌浓度为500 mg/L；当发根农杆菌R1601的菌液OD600=0.6时，草莓叶片毛状根的诱导率最高，而高于或低于该密度，诱导率均呈下降趋势。[结论]建立了发根农杆菌诱导草莓毛状根再生体系，为草莓利用发根农杆菌进行抗除草剂bar基因转化研究奠定基础。

关键词发根农杆菌R1601；草莓；毛状根

草莓(FragariaananassaDuch)为蔷薇科草莓属(Fragaria)多年生草本植物，又名红莓、洋莓、地莓等，原产欧洲。其外观呈心形，鲜美红嫩，果肉多汁，酸甜可口，且有特殊的浓郁水果芳香，被誉为“水果皇后”。 近年来，我国草莓生产发展迅速，陆续培养出一批新品种，栽培面积迅速扩大。发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)是根瘤菌科(Rhizobiacea)农杆菌属(Agrobacterium)的一种革兰阴性细菌，它能够感染大多数双子叶植物、少数单子叶植物以及个别裸子植物[1-2]。其携带的Ri质粒能诱导转化植物产生大量毛状根，发根农杆菌侵染植物所产生的毛状根具有生长速度快、激素自主性和遗传稳定等特点，利用发根农杆菌诱导植物细胞产生毛状根是20世纪80年代发展起来并得到广泛应用的植物基因工程技术，已成为植物转基因研究的重要途径[3-6]。笔者将发根农杆菌R1601涂布至附加不同Carb浓度的培养基上，从而确定毛状根除菌用抗生素浓度，并通过共培养法研究农杆菌侵染草莓叶片产生毛状根的菌液浓度，旨在为进一步介导转化抗草丁瞵草莓奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1植物材料。以安徽省长丰县农业技术推广中心组培室提供的草莓品种丰香叶片为试材。

1.1.2菌种。发根农杆菌R1601购自武汉大学生命科学院中国典型培养物保藏中心。

1.1.3抗生素。羧苄青霉素(Carb)购自长沙欧迈生物科技有限公司，用无菌去离子水配成浓度为100 mg/mL的母液，0.22 μm滤膜抽滤灭菌后，-20 ℃保存备用。

1.1.4培养基。①基本培养基：MS培养基，其固体培养基用8 g/L琼脂固化，高温高压灭菌后备用。②发根农杆菌培养基：蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，pH 6.8±0.2；液体培养基供振荡培养发根农杆菌用，固体培养基则附加琼脂20 g/L，高压灭菌15～20 min。

1.2试验方法

1.2.1发根农杆菌复苏及其培养。

1.2.1.1安瓿管开封。安瓿管用浸过75%乙醇的脱脂棉擦净，用酒精灯火焰加热其顶部，滴少量无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或镊子敲下已破裂的安瓿管顶端。

1.2.1.2菌株复苏培养。用灭过菌的毛细管吸取0.2 mL无菌水，滴入安瓿管中，轻轻振荡，使冻干粉溶解。吸取全部菌体，滴入液体或斜面培养基，并在25 ℃下复苏培养，长出新菌落后，挑取单菌落，接种于液体培养基中，28 ℃、120 r/min振荡培养14 h，4 000 r/min离心8 min，收集沉淀菌体，置于发根农杆菌液体培养基中，活化2～3次，再用MS培养液悬浮并稀释至OD600分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0。

1.2.1.3毛状根除菌用抗生素浓度的确定。将Carb添加至发根农杆菌培养基中(在培养基灭菌后冷却至40 ℃以下加入抗菌素)，使之在培养基中的浓度分别为0、100、300、500、700、1 000 mg/L，将农杆菌涂布至以上培养基中，25 ℃暗处培养3 d,3 d后观察各平板菌落生长情况。

1.2.2草莓叶片毛状根诱导方法的确定。

1.2.2.1共培养法。将丰香草莓的无菌试管苗转接至MS培养基上，25 ℃下暗处预培养2 d。将试管苗叶片剪成叶块，接种于无菌培养皿中，将活化好的菌液倒入培养皿中，共培养20 min，取出，用无菌滤纸吸干多余的菌液，放回原培养基中暗培养2 d，转入含Carb 500 mg/L的MS培养基中，25 ℃暗培养诱导发根。

1.2.2.2直接接种法。用无菌微量进样器吸取活化好的菌液，对丰香草莓无菌叶片进行注射接种，在25 ℃下暗培养诱导发根。

1.2.2.3评价指标。14 d后观察试验结果，每组试验重复5次，取其平均值[5]。毛状根诱导率=产生毛状根外植体数/总外植体数×100%。

1.2.3不同OD600菌液浓度对草莓叶片毛状根诱导率的影响。利用共培养法将活化好的不同OD600菌液倒入培养皿中，共培养20 min取出，用无菌滤纸吸干多余的菌液，放回原培养基中暗培养2 d，然后转入含Carb 500 mg/L的MS培养基中，25 ℃暗培养诱导发根，评价指标同“1.2.2.3”。

2结果与分析

2.1发根农杆菌的复苏及培养通过对发根农杆菌R1601进行复苏增殖培养，发根农杆菌培养成功(图1)。

2.2毛状根除菌用抗生素浓度的确定从图2可以看出，30 d后在100、300 mg/L Carb平板上有菌落生长，随着Carb浓度的增大菌落逐渐减少，当Carb浓度达500 mg/L时完全抑制了菌落的生长，表明Carb最低抑制发根农杆菌的浓度为500 mg/L。

图1　发根农杆菌R1601Fig. 1　Agrobacterium rhizogene R1601

图2　不同Carb浓度对草莓叶片毛状诱导的影响Fig. 2　Effects of different Carb concentration on the induction rate of hairy roots from F.ananassa leaves

2.3不同诱导方法对草莓叶片毛状根诱导率的影响用发根农杆菌R1601感染草莓无菌叶片，通过对共培养法和直接接种法进行比较，结果表明，共培养法的诱导率较高，为10%，且出现分枝较多的根；直接接种法诱导率为0(表1)。同时共培养法最为常用，且效果较好，因此，该试验采用共培养法获得草莓毛状根。

2.4不同OD600菌液浓度对草莓毛状根诱导率的影响由图3可知，当菌液OD600=0.6时，毛状根诱导率最高达16%，而高于或低于该密度，转化率均呈下降趋势。

3讨论

该试验采用一种简便易行的草莓毛状根诱导方法，成功获得了草莓的毛状根，为草莓转基因研究奠定了基础。不同植物种类对发根农杆菌的敏感性有差异，而该差异可通过优化各种处理因素而减小。利用发根农杆菌遗传转化草莓，通过毛状根的诱导、分化培养获得再生植株。毛状根再生植株在形态学上表现根系发达，节根分节较多，侧根发达，

表1不同诱导方法对草莓叶片毛状根诱导率的影响

Table 1Effects of induction method on the induction rate of hairy roots fromF.ananassaleaves

诱导方法Inductionmethod外植体数Explantsnumber诱导率Inductionrate∥%生根情况Rootingsituation直接接种法Directinoculationmethod300无根,接种处褐化严重,逐渐死亡共培养法Co-cul-turemethod3010出现分枝较多的根

生长迅速。发根农杆菌诱导植物产生毛状根的影响因素很多，其中菌液浓度是转化过程中常被调整的因素，菌液浓度过高，发根农杆菌生长过快，不易被抗生素杀死，易导致外植体受到伤害、发生褐化甚至死亡；菌液浓度过低，又无法感染外植体。另外，培养基中添加合适浓度的抗生素能有效抑制农杆菌的生长，从而有效地除菌，抗生素浓度又不能太高，以免对植物细胞产生较大的毒害作用而影响细胞的正常生长。

图3　不同OD600菌液浓度对草莓叶片毛状根诱导率的影响Fig. 3　Effects of OD600 values of Agrobacterium rhizogene R1601 solution on the induction rate of hairy roots from F. ananassa leaves

参考文献

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[2] 张来，罗正伟，张显强，等．发根农杆菌Ri质粒的特征及其应用[J]．安徽农业科学，2010，38(15)：8183-8185．

[3] 魏源文，张向军，陈丽娟.草莓叶片再生体系的建立[J].广西农业科学，2004(1)：17-18.

[4] 陈伟莉，牟旭鹏，刘冬影．毛状根在植物次生代谢产物生产方面应用的研究进展[J]．黑河学院学报，2010，11(4)：122-126．

[5] 冯珂．丹参毛状根培养体系建立及诱导子的作用研究[D]．杨凌：西北农林科技大学，2010．

[6] 王学勇．丹参毛状根基因诱导表达分析及其有效成分生物合成基因的克隆研究[D]．北京：中国中医科学院，2007．

Induction of Hairy Roots ofFragariaananassaDuch byAgrobacteriumrhizogene

ZHU Xiu-lei, LI Ping

(Department of Landscape Gardening, Anqing Vocational and Technical College, Anqing, Anhui 246003)

Abstract[Objective] To establish high-efficient root regeneration system of Fragaria ananassa Duch by Agrobacterium rhizogene. [Method] With cultivar Toyonoka suitably cultivated in Anhui Province as the research material, plant cell was infected by A. rhizogene R1601. Grwoth of Agrobacterium-induced hairy roots from F. ananassa leaves were observed. [Result] A. rhizogene R1601 was successfully cultivated. The effective sterilization concentration of Carb was 500 mg/L. When the OD600of A. rhizogene R1601 was 0.6, the induced frequency of hairy roots was the highest. Otherwise, the induction rate all reduced. [Conclusion] Ahigh-efficient root regeneration system of F. ananassa by A. rhizogene is established, which lays foundation for the researches on bar gene transformation in F. ananassa by using A. rhizogene.

Key wordsAgrobacterium rhizogene R1601; Fragaria ananassa Duch; Hairy roots

作者简介朱秀蕾(1980- )，女，安徽安庆人，讲师，硕士，从事组织培养方面的研究。

收稿日期2016-04-11

中图分类号S 668.4

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)12-121-02