菌株0206产PHA的发酵条件优化

朱九滨, 李爽芹, 梁宝东, 李湘利

(济宁学院生命科学与工程系，山东曲阜 273155)

菌株0206产PHA的发酵条件优化

朱九滨, 李爽芹, 梁宝东, 李湘利

(济宁学院生命科学与工程系，山东曲阜 273155)

摘要[目的]优化菌株0206产PHA株的发酵条件。[方法]以菌株0206为试验菌株，对碳源、氮源、培养基pH和培养时间进行了单因素试验和正交试验。[结果]从活性污泥中分离筛选到高产PHA的菌株0206，通过生理生化鉴定，菌株0206为芽孢杆菌属，菌株0206产PHA最优发酵条件为葡萄糖10 g/L，硫酸铵10 g/L，氯化钠2 g/L，培养基pH 7.0，培养时间48 h。[结论]优化了菌株0206产PHA的发酵条件，为PHA的发酵提供参考。

关键词PHA；生理生化鉴定；发酵条件优化

聚羟基脂肪酸酯(PHA)作为一种新颖的生物材料,其生物组织相容性和可降解性已得到人们的认可,具有良好的应用前景[1]。PHA因具有优越的理化性质,近年来在电学、光学、生物医学等高技术领域中得到广泛应用[2-3]。

PHA在生物体内作为碳源和能源的贮藏物而存在[4]。微生物发酵法生产PHA在国内外都有大量研究,但在生产过程中仍存在一系列问题,尤其是生产能力低和生产成本过高[5],这制约了生物发酵生产PHA工业的扩大和PHA的应用。笔者以从活性污泥中筛选出来的产PHA菌株0206为试验菌株,通过优化发酵条件,比较不同发酵条件下的活菌数,旨在为PHA的发酵提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株。菌株0206：济宁学院生命科学实验中心分离获得。

1.1.2培养基。牛肉膏蛋白胨培养基[6]：牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，NaCl 2 g，水1 000 mL，pH 7.5。生理生化鉴定培养基：蛋白胨水培养基、明胶液化试验培养基、石蕊牛奶试验培养基、葡萄糖利用试验培养基、甲基红试验培养基、过氧化氢酶试验培养基。

1.2菌株0206的生理生化鉴定对筛选出的菌株按照《伯杰细菌鉴定手册》[7]进行菌落形态和生理生化特征鉴定。

1.3菌株0206产PHA的发酵条件优化

1.3.1单因素试验

1.3.1.1碳源对菌株0206产PHA的影响。分别用葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉(接入量为10 g/L)代替牛肉膏蛋白胨培养基中的碳源，接入1 mL摇瓶培养的高产PHA菌株的菌液，摇瓶培养36 h后，吸取1 mL菌液加入装有9 mL无菌水的试管中，以此为10-1稀释菌悬液，用旋涡振荡器混匀。按上述操作顺序，分别制成10-2～10-7梯度稀释菌悬液。取0.1 mL适当稀释的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，培养48h后，对培养基中的菌落数进行统计，做3个平行，计算原培养液中的活菌总数，并结合荧光显微镜观察菌株的荧光强度，以确定不同碳源对菌株产PHA的影响，从而确定最佳碳源。

在确定最佳碳源的基础上，用同样的方法研究碳源浓度对菌株0206生长和产PHA的影响，从而确定该碳源的最适浓度。

1.3.1.2氮源对菌株0206产PHA的影响。牛肉膏蛋白胨培养基在确定碳源及其浓度的基础上，分别用酵母粉、精氨酸、NH4Cl、尿素、硫酸铵(接入量10 g/L)代替优化碳源后培养基中的氮源，按“1.3.1.1”的方法确定最佳氮源及其最适浓度。

1.3.1.3培养基pH对菌株0206产PHA的影响。牛肉膏蛋白胨培养基在确定最佳碳源、氮源的基础上，调节不同初始pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)进行发酵试验，按“1.3.1.1”的方法确定培养基的最佳初始pH。

1.3.1.4培养时间对菌株0206产PHA的影响。以最佳碳源、氮源代替牛肉膏蛋白胨培养基中的碳源和氮源，调节最佳初始pH，接入1 mL摇瓶培养的高产PHA菌株的菌液，摇瓶培养24、30、36、42、48、54、60 h后，按“1.3.1.1”的方法测试不同培养时期菌株0206的生长状况和产PHA情况。

1.3.2正交试验。根据单因素试验结果，选择碳源、氮源、培养基pH及培养时间为影响因素，设计4因素3水平L9(34)的正交试验。按表1进行正交试验，每组试验做3个平行，以活菌数为评价指标，确定产PHA菌株的最佳发酵条件。

表1　正交试验设计因素水平

2结果与分析

2.1形态特征和生理生化鉴定

2.1.1形态特征。高产PHA菌株0206在牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落形态见图1。该菌的菌落形态特征：菌落较小，呈圆形，中间凸起，边缘光滑，不透明，黄色，表面较干燥，易于挑取。

图1　菌株0206菌落形态Fig.1　Colony morphology of strain 0206

2.1.2生理生化鉴定。按照菌落特征和生理生化鉴定结果，参照《伯杰细菌鉴定手册》，并对其进行芽孢染色，将菌株0206初步鉴定为芽胞杆菌属(BacillusCohn)(表2)。

表2植株0206生理生化鉴定结果

Table2Physiologicalandbiochemicalidentificationresultsofstrain0206

鉴定项目Identificationitems鉴定结果Identificationresults鉴定项目Identificationitems鉴定结果Identificationresults明胶液化Gelatinliguefaction液化吲哚试验Indoletest+石蕊牛奶Litmusmilk胨化葡萄糖利用Glucoseutilization产酸甲基红试验Methylredtest-革兰氏染色紫色(+)过氧化氢酶Catalase+

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

Note:“+”indicatespositive,“-”indicatesnegative.

2.2菌株0206产PHA的发酵条件优化

2.2.1单因素试验

2.2.1.1碳源对菌株0206产PHA的影响。由图2可知，不同碳源对菌株0206的影响不同，葡萄糖的平均活菌数最大。在确定菌株最佳碳源(葡萄糖)的基础上，测定葡萄糖的初始浓度对菌株0206的影响，结果见图3。由图3可知，随着葡萄糖浓度的增加，活菌数呈增加趋势，当葡萄糖浓度在6～10g/L时，活菌数呈增加趋势，当葡萄糖浓度在10～14g/L时，活菌数呈减少趋势，结合在荧光显微镜下观察的荧光强度，确定最佳碳源浓度为10g/L。

图2　不同碳源对菌株0206菌落数的影响Fig.2　Effects of different carbon sources on colony number of strain 0206

图3　葡萄糖浓度对菌株0206菌落数的影响Fig.3　Effects of glucose concentration on colony number of strain 0206

图4　不同氮源对菌株0206菌落数的影响Fig.4　Effects of different Nifrogen sources on colony number of strain 0206

2.2.1.2氮源对菌株0206产PHA的影响。由图4可知，不同氮源对菌株0206的影响不同，其中，有机氮源酵母粉和无机氮源硫酸铵的平均活菌数较多，且差别不大，但在荧光显微镜下硫酸铵对菌株0206的荧光强度比酵母粉对菌株0206的荧光强度较强，综合考虑，选择无机氮源硫酸铵为最佳氮源。在确定最佳氮源(硫酸铵)的基础上，测定硫酸铵的初始浓度对菌株0206的影响，结果见图5。由图5可知，随着硫酸铵浓度的增加，活菌数呈增加趋势，当硫酸铵浓度在6～10g/L时，活菌数呈增加趋势，当硫酸铵浓度在10～14g/L时活菌数呈下降趋势，结合在荧光显微镜下观察的荧光强度，确定最佳氮源浓度为10g/L。

图5　硫酸铵浓度对菌株0206菌落数的影响Fig.5　Effects of ammonium sulphate concentration on colony number of strain 0206

2.2.1.3培养基pH对菌株0206产PHA的影响。由图6可知，不同培养基初始pH对菌株0206的影响不同，当pH为6.0～7.0时，活菌数呈上升趋势，当pH为7.0～8.0时，活菌数呈下降趋势，结合在荧光显微镜下观察的荧光强度，确定最佳初始pH为7.0。

图6　培养基初始pH对0206菌株菌落数的影响Fig.6　Effects of culture medium initial pH on colony number of strain 0206

2.2.1.4培养时间对菌株0206产PHA的影响。由图7可知，随着培养时间的增加，活菌数呈增加趋势，当培养时间在24～48h时，活菌数呈增加趋势，荧光强度增加，当培养时间在48～60h时，活菌数呈下降趋势，荧光强度减弱，故PHA的积累与菌体生长呈明显的正相关，故确定最佳培养时间为48h。

图7　培养时间对菌株0206菌落数的影响Fig.7　Effects of incubation time on colony number of strain 0206

2.2.2正交试验。由表3可知，对菌株0206生长的影响由大到小依次为A、D、B、C，即葡萄糖添加量影响最大，培养时间次之，培养基pH影响最小。方差分析表明，4个因素中，葡萄糖对菌株影响较显著，培养基pH的影响较小。菌株0206发酵条件的最优组合为A2B2C2D2。经验证试验，在该条件下平均活菌数为2.59×109CFU/mL，较9组试验最高组所得的菌落数(2.45×109CFU/mL)高，故确定最优发酵条件为葡萄糖10g/L，硫酸铵10g/L，氯化钠2g/L培养基pH为7.0，培养时间为48h。

表3　正交试验结果

3结论与讨论

该研究通过形态特征及生理生化鉴定可以得出，产PHA菌株0206为芽孢杆菌属，对碳源、氮源、培养基初始pH和培养时间分别进行单因素和正交试验分析，结果显示菌株0206产PHA最佳发酵条件为葡萄糖10g/L，硫酸铵10g/L，氯化钠2g/L,培养基pH7.0，培养时间48h。

该研究是基于实验室摇瓶培养的条件下完成的，鉴于大规模发酵的工艺条件与摇瓶有较大差别，经摇瓶筛选出来的高产突变株未必在发酵罐内也高产，因此，关于PHA高产菌株的生产试验还有待于进一步研究。该试验虽只对一株菌进行了研究，但仍可为其他产PHA菌株的培养提供参考。

参考文献

[1] 杨宇,徐爱玲,张燕飞,等.生物合成材料聚β-羟基丁酸(PHB)的研究进展[J].生命科学研究,2006,10(4):61-67.

[2] 李懋，王朝云,吕江南,等.可生物降解材料聚羟基脂肪酸酯(PHA)的合成与应用概述[J].环境科学与管理, 2009,34(12)：144-148.

[3] 金大勇,顾国维,杨海真.生物降解塑料聚羟基烷酸(PHA)的研究进展[J].氨基酸和生物资源,2004,26(3):30-32.

[4] 王琴,陈银广.活性污泥合成聚羟基烷酸(PHAs)的研究进展[J].环境科学与技术,2007,30(5)：112-114.

[5] RAY S,PRAJAPATI V,PATEL K.Optimization and characterization of PHA from isolate Pannonibacter phragmitetus ERC8 using glycerol waste[J].International journal of biological macromolecules,2016,86:741-749.

[6] BUCHANAN R E,GIBBONS N E.伯杰细菌鉴定手册[M].中国科学院微生物研究所,译.北京:科学出版社,1984.

[7] 赵斌,何绍江.微生物学实验[M].北京:科学出版社,2010.

Optimization of Fermentation Conditions of PHA-producing Strain 0206

ZHU Jiu-bin, LI Shuang-qin, LIANG Bao-dong et al

(Life Science and Engineering Department of Jining University, Qufu, Shandong 273155)

Abstract[Objective] The aim was to study fermentation conditions of PHA-producing strain. [Method] With strain 0206 as test material, fermentation conditions about carbon, nitrogen, pH value and the culture time were analyzed by single factor experiment and orthogonal experiment. [Result] High PHA-producing strain 0206, which was isolated from activated sludge filter, was identified as Bacillus cohn through the physiological-biochemical identification. After optimization, fermentation conditions were: 10 g/L glucose, 10 g/L ammonium sulfate, 2 g/L NaCl, medium pH 7.0, incubation time for 48 hours. [Conclusion] The study provides reference for fermentation of PHA.

Key wordsPHA; Physiological-biochemical identification; Fermentation condition optimization

基金项目济宁学院青年科研基金项目(2012QNKJ08)。

作者简介朱九滨(1980- ),男,山东滨州人,讲师,硕士,从事微生物学教学和研究。

收稿日期2016-04-06

中图分类号Q 93

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)12-123-03