小鼠口服五氯柳胺的急性毒性研究

张吉丽， 李 冰， 司鸿飞， 周绪正， 程富胜， 张继瑜

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州 730050)

小鼠口服五氯柳胺的急性毒性研究

张吉丽， 李 冰， 司鸿飞， 周绪正， 程富胜， 张继瑜*

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州 730050)

摘要[目的]为初步评价五氯柳胺的安全性，对其进行小鼠的急性毒性试验。[方法]预试验采用递增法确定给药的剂量范围和正式试验分组。正式试验采用简化寇氏法，灌胃给药，观察7 d，观察给药后小鼠的体征变化，统计死亡率和死亡时间，计算LD50值及其95%置信区间。[结果]小鼠口服五氯柳胺的LD50为1.130 g/kg，95%置信区间为0.940～1.359 g/kg。[结论]按照化学物的急性毒性剂量分级，五氯柳胺为低毒化学物。

关键词五氯柳胺；小鼠；急性毒性试验；LD50

肝片吸虫病是由肝片吸虫引起的家畜常见的人畜共患病。该病遍及世界各地，严重阻碍了畜牧养殖业的健康发展，对保障食品安全、公共卫生安全和环境生态安全构成了极大的威胁，同时也造成了巨大的经济损失。抗肝片吸虫类药物是目前防治肝片吸虫病最有效的手段。五氯柳胺(Oxyclozanide)是水杨酰苯胺类化学合成抗肝片吸虫的药物，主要用于治疗牛和羊的肝片吸虫感染，在抗绦虫和线虫等蠕虫感染方面也有较好的治疗效果。五氯柳胺通过阻碍虫体线粒体的氧化磷酸化过程，使能量不能合成，虫体因能量耗尽而死[1]。国外有学者报道五氯柳胺的临床抗虫效果显著，明显优于阿苯达唑、萘托比胺、氯氰碘柳胺等药物[2-3]。但是，国内对五氯柳胺的系统性研究报道较少。为了初步评价五氯柳胺的安全性，笔者以小鼠为实验动物，进行了急性毒性试验。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物。SPF级昆明系小鼠80只，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，体重18～22 g，雌雄各半，雌性未产未孕。室温下饲养3～5 d，自由采食饮水，以适应试验环境。

1.1.2受试药品。五氯柳胺原料药，购自常州亚邦齐晖医药化工有限公司，批号为RD1506001。试验前，精密称取五氯柳胺原料药，以羧甲基纤维素钠为助悬剂，配制0.2 g/mL的混悬剂，待用。

1.2方法

1.2.1预试验。采用递加法进行预试验。将20只昆明系小鼠，体重为18～22 g，平均分为5组，每组4只，雌雄各半，分别给小鼠称重，计算给药剂量。最高剂量组给药剂量为3.375 g/kg BW，最低剂量组给药剂量为0.667 g/kg BW。试验前，禁食8～12 h，自由饮水。灌胃给药，观察7 d，记录小鼠的死亡数，根据预试验的最小致死剂量(LD100)和最大耐受剂量(LD0)来确定正式试验给药剂量范围、组数(N)以及各组间剂量比(r)。

1.2.2急性毒性试验。根据预试验得到的最小致死剂量(LD100)为3.375 g/kg，最大耐受剂量(LD0)为0.667 g/kg，采用简化寇氏法计算正式试验组数以及各组间剂量比。

五氯柳胺正式试验分为6组，包括5组不同剂量给药组和1组空白对照组。将60只小鼠，随机分为6组，5个给药组的给药剂量分别为3.375、2.250、1.500、1.000和0.667 g/kg。试验前，禁食8～12 h，自由饮水。根据体重计算给药剂量。空白对照组给予等量的饮用水。灌胃给药后，前3 h持续观察；3～8 h，每15 min观察1次；8～12 h，每30 min观察1次；12 h后，每2 h观察1次；24 h后，每4 h观察1次；3 d后，每天观察3次，直至第7天结束。观察小鼠的外观体征、饮食、饮水、精神状态、行为活动等，记录小鼠死亡时间、死亡组别和死亡数量，对死亡动物进行剖检进行切片处理，与空白对照组对比，观察病理变化。采用改良寇氏法计算LD50及其95%置信区间。

LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]

(1)

(2)

LD50的95%置信区间= lg-1(lgLD50±1.96×SX50)

(3)

式中,Xm为最大剂量的对数；i为组距，相邻2组剂量对数值之差；p为各剂量组死亡率；q为各剂量组存活率；∑p为各剂量组死亡率之和；n为各组动物数；SX50为lgLD50的标准误差。

2结果与分析

2.1预试验结果根据五氯柳胺原料药急性毒性预试验得到的最小致死剂量(LD100)为3.375 g/kg，最大耐受剂量(LD0)为0.667 g/kg。因此，确定正式试验的组数(N)为5，各组之间的剂量比值r为1.5。

2.2急性毒性试验结果

2.2.1临床症状以及剖检病理变化。据观察，给药后动物表现出的症状如下：给药后出现精神沉郁，伏卧不动，眼睛微闭，被毛凌乱，食欲减退，给药3 h后出现死亡现象，死亡时间集中在3～12 h，死亡前出现全身震颤、侧翻现象，大约持续5 min死亡。给药36 h后，再无死亡现象，但高剂量存活小鼠依然表现为精神沉郁，3 d后逐渐恢复饮食、饮水。但是，将存活小鼠体重变化与空白组进行对比发现，给药组小鼠体重增长缓慢。第8天后，对全部小鼠进行剖检，与空白对照组相比，发现给药组肝有出血点、脾肿大、肾的质地脆且易碎、胃壁薄而透明等现象，且高剂量组症状明显。

2.2.2半数致死量(LD50)及95%置信区间。五氯柳胺混悬剂试验组的死亡数如表1所示。小鼠口服五氯柳胺的LD50为1.130 g/kg，95%的置信区间为0.940～1.359 g/kg。

表1　五氯柳胺原料药正式试验结果

3讨论

该试验选用SPF级昆明系小鼠为实验动物，保证实验动物本身清洁无污染，有效消除试验误差。在给药过程中，严格按照灌胃给药的操作，以防由于灌胃方法不当而导致小鼠死亡，影响试验结果的准确性。

由于五氯柳胺不溶于水，所以在配制供试品过程中加入羧甲基纤维素钠作为助悬剂，配制五氯柳胺供试品浓度为0.2 g/mL。但考虑到小鼠的胃容量，一般给药量为每10 g体重的给药量为0.1～0.2 mL[4]。因此，在给药过程中，因为给药体积过大，需要进行多次给药，2次给药时间间隔1～2 h，给药体积不得超过0.4 mL，防止小鼠因灌胃受试物的体积过大而撑死。

五氯柳胺作为一种高效抗肝片吸虫化学合成药物，临床抗虫效果显著。但是，因其水溶性差，有一定的毒性，限制了其临床应用。研究开发一种或几种五氯柳胺的上市制剂，对兽医临床防治肝片吸虫病具有重要意义。该试验结果可为今后五氯柳胺新制剂的开发和临床安全有效用药提供参考依据。

参考文献

[1] 刘祥宜,朱建民,张建峰，等.五氯柳胺的合成[J].浙江化工，2010,41(8):11-12.

[2] SANABRIA R， MORENO L， ALVAREZ L，et al.Efficacy of oxyclozanide against adultParamphistomumleydeniin naturally infected sheep[J].Veterinary parasitology，2014,206:277-281.

[3] ARIAS M S,SANCHIS J,FRANCISCO I,et al.The efficacy of four anthelmintics againstCalicophorondaubneyiin naturally infected dairy cattle[J].Veterinary parasitology,2013,197:126-129.

[4] 农业部兽药评审中心.兽药研究技术指导原则汇编[M].北京:化学工业出版社，2012:11.

Study on the Acute Toxicity of Oxyclozanide in Mice by Oral Administration

ZHANG Ji-li, LI Bing, SI Hong-fei, ZHANG Ji-yu*et al

(Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS, Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development of Ministry of Agriculture, Key Laboratory of New Animal Drug Project of Gansu Province, Lanzhou, Gansu 730050)

Abstract[Objective] In order to evaluate the safety of Oxyclozanide, the acute toxicity test in mice was conducted. [Method] The incremental method was used to determine the groups and dosage of the formal experiment in preliminary experiment. According to the simplified Karber's method in the formal experiment, after giving medicine lavage and observing for 7 days, the change of sign was observed after administration in mice, the mortality and death time was recorded, the LD50and 95% confidence interval was calculated. [Result] The LD50of Oxyclozanide in mice was 1.130 g/kg and 95% confidence interval was 0.940-1.359 g/kg. [Conclusion] According to the classification of acute toxicity dosages of chemicals, Oxyclozanide is the low toxic chemical.

Key wordsOxyclozanide; Mice; Acute toxicity test; LD50

基金项目“十二五”国家科技支撑计划项目(2015BAD1101)；国家现代农业产业技术体系专项(CAR-38)。

作者简介张吉丽(1992- )，女，黑龙江大庆人，硕士研究生，研究方向：动物抗寄生虫药。*通讯作者，研究员，博士，博士生导师，从事兽医药理学与毒理学研究。

收稿日期2016-03-13

中图分类号S 865.1+3

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)12-148-02