咪唑斯汀对小鼠接触性皮炎的治疗作用及机制研究

付曼妮，解翠林,石　年

(鄂东医疗集团黄石市中心医院 湖北理工学院附属医院普爱院区皮肤科，湖北 黄石　435000)

咪唑斯汀对小鼠接触性皮炎的治疗作用及机制研究

付曼妮，解翠林,石年

(鄂东医疗集团黄石市中心医院 湖北理工学院附属医院普爱院区皮肤科，湖北 黄石435000)

摘要：目的研究咪唑斯汀对小鼠反应性接触性皮炎(ACD)的治疗作用，探讨其可能机制。方法采用2,4 - 二硝基氟苯(DNFB )建立小鼠背部ACD 模型，建模成功后将其随机分为模型组、咪唑斯汀组和阳性对照醋酸地塞米松组，每组10只，另外选取10只未处理小鼠作为对照组。用药组采取灌胃给药进行治疗，对照组和模型组给予同体积生理盐水。分别在用药后24 h和72 h测定各组皮肤厚度、皮肤肿胀度，ELISA法测定各组小鼠血清及皮肤组织TNF-α、IL-4、 IL-12的水平。结果与对照组相比，ACD组皮肤厚度和皮肤肿胀度显著增加 (P<0.05 )；血清及皮损组织中TNF-α、IL-12水平显著升高( P<0.05 )，而IL-4水平无明显变化(P>0.05)。咪唑斯汀能显著抑制ACD小鼠皮肤肿胀及TNF-α、IL-12 水平，对IL-4水平无明显影响。结论咪唑斯汀对ACD模型小鼠有良好的治疗作用，可能与降低Th1型炎症因子水平有关。

关键词：皮炎,接触性；肿瘤坏死因子α；白细胞介素4；白细胞介素12；小鼠

反应性接触性皮炎( allergic contact dermatitis，ACD )是由抗原特异性T细胞介导的皮肤过敏性疾病，通常是由皮肤直接接触化学物质所致[1]。随着社会经济的发展，ACD逐渐成为一种普遍的职业病。大量研究表明多种细胞因子，如IFN-γ、IL-2、IL-4在ACD的发病中其重要作用[2-3]。咪唑斯汀是一种特异性外周组胺H1受体拮抗剂，临床上常用于荨麻疹的治疗。另有报道显示，咪唑斯汀还具有抗过敏、抗炎作用[4]。为进一步证实其抗炎作用，本研究采用DNFB建立小鼠ACD模型，观察咪唑斯汀对其的疗效并探究其可能机制。

1材料

1.1实验动物SPF级雄性昆明小鼠(购于湖北省疾控中心实验动物中心)40只，体重(30±5)g。饲养于室温22～25 ℃，相对湿度40%～50%环境下，混合饲料喂养，自由饮水。

1.2主要药品与试剂咪唑斯汀原料(西安杨森制药有限公司)用5%羧甲基纤维素钠配制成0.33 g·L-1混悬液，醋酸地塞米松原料(天津力生制药有限公司)用5%羧甲基纤维素钠配制成0.025 g·L-1混悬液，DNFB(Sigma公司)配制成0.2%及0.5%的丙酮溶液。TNF-α酶联免疫试剂盒(美国Cayman公司)，IL-4、IL-12酶联免疫试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司)。

2方法

2.1ACD模型建立将40只昆明小鼠随机分为对照组、模型组、咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组四组，每组10只。实验小鼠喂养2周后，腹部同一部位除毛，暴露皮肤；实验第1天和第2天于去毛部位涂抹0.5% DNFB溶液25 μL各致敏一次。第6天在小鼠背部右侧选取3 cm × 2 cm区域除毛，涂抹0.2% DNFB 25 μL激发。左侧3 cm × 2 cm剃毛区域为对照[5]。在致敏前1天开始，咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组按3.33 mg ·kg-1和0.25 mg·kg-1剂量灌药，每天1次，连续5 d。激发后立即灌药，1次/d，连续灌药3 d。

2.2皮肤厚度及肿胀度测定激发皮炎24 h和72 h后，剪取背部右侧及对称左侧皮肤，用电子游标卡尺测量皮肤厚度，测量3次，取平均值；然后用直径6 mm圆形打孔器打取两侧相同面积皮肤，称重，计算对应的皮肤肿胀度。计算公式：皮肤肿胀度 = (炎症区域皮肤重量 - 健康区域皮肤重量)/健康区域皮肤重量×100 %。

2.3Elisa法测定小鼠血清及皮肤组织TNF-α，IL-4， IL-12水平激发皮炎24 h和72 h后，分别处死各组小鼠5只，摘取眼球取血，4℃静置过夜后12 000 r·min-1离心，分离血清，皮肤组织匀浆后测定蛋白浓度，严格按照Elisa试剂盒说明书方法测定血清及皮肤组织上清液中细胞因子TNF-α，IL-4，IL-6，IL-12水平。

3结果

3.1咪唑斯汀对DNFB诱导的皮肤肿胀有明显抑制作用与空白对照组比较，激发皮炎24 h后，模型组小鼠背部皮肤潮红、充血，明显肥厚，咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组小鼠背部皮肤轻微充血，肿胀不明显，皮肤厚度相对于模型组均差异有统计学意义(P<0.05 )；激发皮炎72 h后咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组皮肤厚度亦显著小于模型组(P<0.05)。进一步测定各组小鼠背部皮肤肿胀度，结果显示激发皮炎24 h和72 h后，咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组皮肤肿胀度显著小于模型组(P<0.05)。说明咪唑斯汀能明显抑制DNFB诱发的背部皮肤充血水肿，且效果与醋酸地塞米松相当。见图1、表1。

3.2咪唑斯汀对血清细胞因子水平的影响诱发皮炎24 h后，与空白对照组相比，模型组血清TNF-α、IL-12水平显著上升(均P<0.05)，IL-4无明显变化(P>0.05)；与模型组相比，咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组炎症因子TNF-α、IL-12显著降低(均P<0.05)，IL-4水平亦无明显变化(P>0.05)。诱发皮炎72 h后，模型组TNF-α、IL-12水平虽有所下降，但仍高于空白对照组(均P<0.05)；咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组炎症因子TNF-α、IL-12水平进一步降低，IL-4水平无明显变化(P>0.05)。比较咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组上述相关炎症因子水平，结果显示均差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

3.3咪唑斯汀对皮损组织细胞因子水平的影响诱发皮炎24 h后，模型组皮损组织TNF-α、IL-12水平显著高于空白对照组(均P<0.05)，而IL-4无明显变化(P>0.05)。与模型组相比，咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组炎症因子TNF-α、IL-12显著降低(均P<0.05)，IL-4水平亦无明显变化；诱发皮炎72 h后，模型组TNF-α、IL-12水平虽有所下降，但仍高于对照组(均P<0.05)。咪唑斯汀组和醋酸地塞米松组炎症因子TNF-α、IL-12进一步降低，IL-4水平无明显变化(P>0.05)。见表3。

4讨论

ACD是由一种由T细胞介导的IV型变态反应[6]，临床表现为皮肤黏膜接触致敏原后出现弥漫性丘疹、红肿充血。由于其抗原大都属于简单化学物质，很难避免，因此其发病十分普遍，严重影响患者的生活质量。

对照组 模型组 咪唑斯汀组醋酸地塞米松组

图1　药物治疗72 h后各组小鼠皮肤大体观

注：与空白对照组比较，aP< 0.05；与模型组比较，bP< 0.05。

表2　用药后各组小鼠血清细胞因子水平比较/ng·L-1

注：n=5，与空白对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

表3　用药后各组小鼠皮损组织细胞因子水平比较/ng·L-1

注：n=5，与空白对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

DNFB是一种常见的化学致敏剂，具致敏和诱发接触性皮炎的双重功能，广泛应用于接触性皮炎动物模型的制备[7]。通常采用DNFB建立小鼠耳廓ACD模型，但小鼠耳郭无皮下脂肪层，较薄，不易对耳廓厚度和肿胀度进行精确测定[8]。本研究在传统ACD模型的基础上，参照冯浩等[9]的方法建立小鼠背部ACD模型，此模型既能很好的模拟ACD的病理特征，而且克服了传统耳廓ACD模型的缺陷。实验结果显示，ACD模型组背部皮肤出现潮红、充血，明显肥厚等典型的ACD症状。

目前国内外大量研究表明，Th1型和Th2型细胞均参与了ACD的免疫反应，但ACD主要由Th1型细胞免疫反应所介导[10-11]。TNF-α和IL-12均由Th1型细胞所分泌。在ACD的激发期，T细胞接触抗原后TNF-α的释放迅速增加，刺激朗格汉斯细胞迁移，作用于血管内皮细胞，诱导多种细胞因子释放，引起皮肤炎症反应[12-13]。IL-12能够促进Th1型细胞分泌IFN-γ，形成正反馈调节，增强Th1细胞的免疫应答[14]。本研究结果也显示ACD组小鼠血清及皮损组织TNF-α和IL-12水平显著升高，而血清及皮损组织IL-4水平与对照组相比无明显变化。此结果也表面Th1型细胞免疫在ACD中起主导作用。咪唑斯汀是一种强效、特异选择性组胺H1受体拮抗剂，兼具抗炎和抗过敏的双重功效。研究表明，咪唑斯汀通过抑制5-脂氧合酶活性来减少白三烯的产生，从而抑制花生四烯酸所诱导的皮肤炎症反应[15-16]。本研究结果显示，咪唑斯汀能明显抑制DNFB诱发的小鼠背部皮肤充血水肿，且能显著降低血清及皮损组织中TNF-α和IL-12水平。提示咪唑斯汀对ACD的抑制作用可能与其抑制Th1型反应有关。

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Therapeutic effect and discussion of mechanism of mizolastine on murine allergic contact dermatitis

FU Man-ni,XIE Cui-lin，SHI Nian

(DepartmentofDermatology,HuangshiCentralHospitalPu-AiBranch,theAffiliatedHospitalofHubeiPolytechnicUniversity,EdongHealthcareGroup,Huangshi435000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the efficacy of Mizolastine in the treatment of allergic contact dermatitisin (ACD) mice and its possible mechanisms.MethodsThe DNFB was applied on the dorsum of mice to produce the allergi-c contact dermatitis models.Total of forty mice were randomly divided in to nor mal control group,model group,mizolastine group,dexamethasone acetate group with 10 mice in each group.At 24 hours and 72 hours after the beginning of treatmen,central thickness and the swelling of dorsal skins were examined.The leve ls of TNF-α,IL-12,IL-4 in serum and tissue of skin lesion were determined by ELISA method.ResultsCompared with the controlgroup,the ACD group showed a significant increase in thickness and swelling degree of dorsal skin,levels of T-NF-α,IL-12 in serum and tissue of skin lesion (P<0.05).The levels of IL-4 in serum and tissue of skin lesion were not changed (P>0.05).Application of the mizolastine can effectively suppress swelling degree of dorsal skin,reduce levels of TNF-α,IL-12,but did not cause significant changes in serum levels of IL-4 in mice with ACD.ConclusionMizolastine had good th erapeutic effect on allergic contact dermatitis mode1 of mice,and the mechanism might be related to suppression of Th1 cytokine.

Key words:Dermatitis,Contact；Dermatitis,Contact；Interleukin-4；Interleukin-12；Mice

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.006

(收稿日期：2015-12-21，修回日期：2016-02-07)