CYP450酶基因多态性对丙戊酸血药浓度的影响

张，徐善森，刘长文，杨帆，陈亚南，肇丽梅Δ

(1.中国医科大学附属盛京医院 药学部，辽宁 沈阳 110004；2.东北制药集团沈阳第一制药有限公司，辽宁 沈阳 110869)

CYP450酶基因多态性对丙戊酸血药浓度的影响

(1.中国医科大学附属盛京医院 药学部，辽宁 沈阳 110004；2.东北制药集团沈阳第一制药有限公司，辽宁 沈阳 110869)

目的 探究CYP2C9、CYP2A6和CYP2B6基因多态性对单用丙戊酸(Valproic acid，VPA)治疗的癫痫患儿血药浓度的影响。方法 收集单用VPA治疗的癫痫患儿400例，记录患儿的年龄、性别、体质量、日服药剂量等基本信息；应用荧光偏振免疫法(fluorescence polarigation immunoassay，FPIA)测定VPA血药浓度；采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段，分别采用直接测序法、巢式PCR法和质谱法检测CYP2C9*3、 CYP2A6*4和CYP2B6*6位点的基因型。应用单因素方差分析(ANOVA)考查基因多态性对VPA血药浓度的影响。结果 400例癫痫患儿CYP2C9*3、CYP2A6*4、CYP2B6*6的等位基因频率分别为2.75%、6.50%、23.00%，其中CYP2C9*3和CYP2A6*4基因多态性可以显著升高VPA标准化血药浓度(concentration dose ratio，CDRVPA)(P=0.024；P=0.000)，但CYP2B6*6基因多态性对CDRVPA的影响差异无统计学意义(P=0.95)。结论 CYP2C9*3和CYP2A6*4等位基因多态性均能影响CDRVPA，因此CYP2C9*3和(或)CYP2A6*4等位基因携带的患儿VPA使用剂量应低于常规剂量，以避免发生不良反应。

丙戊酸；CYP450酶；基因多态性；血药浓度

丙戊酸(Valproic acid，VPA)是临床广谱抗癫痫药物，相对于其它抗癫痫药物，VPA疗效高，耐受性较好，但其体内代谢受多种因素影响，个体差异较大，需要监测血药浓度，进行个体化给药治疗[1]。VPA是简单的支链脂肪酸，主要经细胞色素P450酶(CYP450)、线粒体β-氧化和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase，UGT)3种途径代谢[2]。

近年来，随着药物基因组学和遗传药理学的发展，针对VPA在药物代谢过程中的个体差异和代谢酶基因多态性的研究也较多。研究表明[3-7]：在CYP450代谢途径中，CYP2C9、CYP2A6和CYP2B6是代谢VPA的主要酶，其基因多态性与丙戊酸的代谢密切相关，且野生型CYP2C9*1、CYP2A6*1、CYP2B6*1代谢丙戊酸的能力明显强于突变型CYP2C9*3、 CYP2A6*4和CYP2B6*6。VPA清除率下降，在体内蓄积，可能会诱发不良反应，如肉毒碱减少、血氨增加、血象异常等[8]。同时，也有研究证实[9-10]，VPA的肝毒性代谢产物主要经CYP途径产生。然而，国内关于癫痫患儿体内CYP酶基因多态性对VPA代谢影响的报道较少。本研究旨在通过分析单用VPA的癫痫患儿CYP2C9*3、CYP2A6*4和CYP2B6*6的基因多态性对VPA血药浓度的影响，以期为临床合理用药提供参考，从而减少不良反应的发生，实现个体化治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年1月～2015年7月在中国医科大学附属盛京医院进行常规VPA血药浓度监测的患儿血样，共400例。其中男212例，女188例；患儿平均年龄(8.05±6.28)岁，平均体质量(18.28±8.81)kg，平均日服药剂量/每公斤体重为(16.90±6.53)mg/kg。

入组标准：①临床和脑电图检查均符合癫痫诊断；②单用丙戊酸治疗且服药3个月以上，血药浓度达到稳态水平；③肝、肾功能指标正常；④体重指数(BMI)在18～24范围内。

排除标准：①非癫痫性发作，如假性发作；②颅脑CT或MRI提示有进行性脑部器质性疾病，如炎症肿瘤变性疾病者；③不能完成长期随访的患儿。

1.2 方法 患儿服用VPA达到稳态浓度(经过4～5个半衰期；丙戊酸的半衰期为7～10h)后，于次日服药前采集静脉血2～3 mL(稳态谷浓度)于采血管中，分离血清，采用荧光偏振免疫法(FPIA，美国雅培公司)测定VPA的血药浓度，质控误差<5%。

DNA抽提采用经典的酚-氯仿法，提取DNA后测定OD值(A260/A280≈1.8)，检测DNA水平。

CYP2C9*3扩增产物采用直接测序方法(北京六合华大生物科技股份有限公司)，根据不同峰图判断基因型。CYP2A6*4基因分型采用巢式PCR[11]，采用Primer 5.0软件设计引物，CYP2C9*3和CYP2A6*4位点引物序列见表1。混匀后的反应体系放入TaKaRa PCR扩增仪进行扩增，产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。CYP2B6*6的基因分型采用质谱法-MALDI-TOF system(上海生工生物工程股份有限公司)检测。

为排除患儿体质量对VPA血药浓度的影响，将血药浓度的测定结果进行标准化，标准化血药浓度(concentration dose ratio，CDR)=VPA血药浓度/(日剂量/体质量)。

表1 CYP2C9*3和CYP2A6*4基因多态性位点引物序列

2 结果

2.1 CYP2C9*3基因分型 CYP2C9*3位点PCR产物及测序结果见图1。

图1 CYP2C9 *3位点PCR产物及基因测序结果图Ⅰ：PCR产物的电泳图；Ⅱ：CYP2C9 *3位点的测序图，A：野生纯合型(AA)；B：突变杂合型(AC)Fig.1 PCR products and sequencing results of CYP2C9 *3 gene Ⅰ:Electro phoresis results of PCR products;Ⅱ:Sequencing results of CYP2C9*3，A:wild homozygous type(AA);B:Mutant hybrid type(AC)

2.2 CYP2A6*4基因分型 CYP2A6*4位点PCR产物电泳结果见图2。其中1～3、4～6、7～9泳道分别为3例患者的3次PCR产物。分析可知1～3泳道患者基因型为CYP2A6*1/*1，4～6泳道患者基因型为CYP2A6*4/*4，7～9泳道患者基因型为CYP2A6*1/*4。

图2 CYP2A6*4基因巢式PCR产物电泳图M：DL2000 marker；1、4、7：PCRⅠ反应产物；2、5、8：引物8F6和R2反应产物，即CYP2A6*1；3、6、9：引物8F7和R2的反应产物，即CYP2A6*4Fig.2 Nested PCR products of CYP2A6*4 geneM:DL2000 marker;1,4,7:PCRⅠproducts;2,5,8:products(CYP2A6*1) of primer 8F6 and R2;3,6,9:products (CYP2A6*4) of primer 8F7 and R2

2.3 CYP2B6*6基因分型 CYP2B6*6质谱法基因分型结果见图3、图4。

图4 CYP2B6*6 785A>G位点质谱图A：CYP2B6 A785G野生型；B：CYP2B6 A785G突变杂合型；C：CYP2B6 A785G突变纯合型Fig.4 Mass spectrogram of CYP2B6*6 785A>G siteA:CYP2B6 A785G wild type;B:CYP2B6 A785G mutant hybrid type;C:CYP2B6 A785G mutant homozygous type

2.4 CYP2C9*3、CYP2A6*4和CYP2B6*6基因型分布 癫痫患儿CYP2C9*3、CYP2A6*4和CYP2B6*6基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。各SNP位点等位基因、基因型分布情况见表2。CYP2C9*3等位基因频率为2.75%，CYP2A6*4等位基因频率为6.50%，CYP2B6*6等位基因频率为23.00%。

表2 CYP2C9*3、CYP2A6*4和CYP2B6*6位点等位基因和基因型频率分布

2.5 不同基因型对VPA血药浓度以及CDRVPA的影响 VPA血药浓度在CYP2C9*3、CYP2A6*4和CYP2B6*6 3种基因型中差异均无统计学意义(P=0.46，P=0.75，P=0.62)。但CYP2C9*1/*3基因型的CDRVPA显著高于CYP2C9*1/*1(P=0.024)；CYP2A6*4/*4基因型的CDRVPA显著高于CYP2A6*1/*4和CYP2A6*1/*1(P=0.000)；而CYP2B6*6的3种基因型对CDRVPA并无影响(P=0.95)。见表3。

表3 癫痫患儿基因型与血药浓度的关系(n=400)

3 讨论

本研究考察了VPA的CYP代谢途径中主要代谢酶CYP2C9、CYP2A6和CYP2B6在400例癫痫患儿中CYP2C9*3、CYP2A6*4和CYP2B6*6等位基因及基因型频率的分布，结果显示，3个等位基因频率分别与文献上报道的亚洲人频率2%～5%[12]、6.7%～24.2%[13]以及中国汉族人频率18.4%较为一致[14]，并未发现CYP2C9*3/*3纯合突变。

CYP2C9基因位于人染色体10q24.2上，全长约50.71kb，有9个外显子，8个内含子，编码490个氨基酸残基。CYP2C9*3是外显子7的第1075基因座上的碱基A突变为C，结果致使酶的活性降低[15]。CYP2A6具有遗传多态性，目前已经发现了30余种等位基因，在东方人中频率较高的是CYP2A6*1A、CYP2A6*1B、CYP2A6*4和CYP2A6*9[11,16-17]。有研究证实，CYP2A6*4等位基因在亚洲人中的突变率较高，CYP2A6*4(包括 *4A、 *4B、*4C和*4D)等位基因是CYP2A6基因的整体缺失，源于高度相似的CYP2A6与CYP2A7基因的不平等交换(从内含子8到3’端)，导致CYP2A6酶活性丧失[18]。人CYP2B6由9个外显子和8个内含子组成，全长2.8kb，编码由491个氨基酸组成的功能蛋白。CYP2B6自发现以来，因蛋白含量及催化活性呈明显的个体差异[19]，其基因多态性受到关注。至今已确定了CYP2B6的29个等位基因，发现了100多个单核苷酸多态性突变。CYP2B6*6包含2个突变位点，即4号外显子上的G516T和5号外显子上的A785G，在我国汉族人中的突变率分别约为0.21和0.28。

CYP2C9、CYP2A6和CYP2B6是VPA代谢产生肝毒性代谢产物的主要代谢酶[10,20]，因此，探究其基因多态性与VPA血药浓度的相关性具有重要的意义。慢代谢型(CYP2C9*1/*3、CYP2A6*1/*4&*4/*4、CYP2B6*1/*6&*6/*6)使VPA的清除率下降，导致患儿体内VPA蓄积，肝毒性代谢物增多，易诱发肝损伤等不良反应。本研究结果显示，CYP2C9*3和CYP2A6*4的患儿CDRVPA显著升高，与前人研究较一致[5,21-22]。而CYP2B6*6 的3种基因型对应的CDRVPA差异并无统计学意义，与文献报道相反。分析原因有以下2点：其一，谭兰等[23]的研究，病例数较少，仅70例，可能会出现假阳性结果；其二，Kiang等[24]通过探讨肝微粒体中CYP2C9、CYP2A6和CYP2B6对VPA代谢的影响，发现经CYP2C9生成4-ene-VPA、4-OH-VPA和5-OH-VPA的速率较快，经CYP2A6生成3-OH-VPA的速率较快，而CYP2B6对代谢物生成的贡献并不占主导地位，因此猜测VPA经CYP2B6代谢的比例较小，从而导致本研究并未发现CYP2B6*6对CDRVPA有显著影响。

本研究首次考察了在口服VPA的中国汉族癫痫患儿CYP2C9*3、CYP2A6*4和CYP2B6*6基因型情况对血药浓度的影响。在临床使用VPA治疗时，如患儿携带CYP2C9*3和/或CYP2A6*4，建议先给予较小的VPA剂量，并定期监测血药浓度，以免因VPA浓度过高而引起不良反应。

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(编校：吴茜)

Effects of CYP450 enzymes polymorphisms on plasma Valproic acid concentration

ZHANG Ti1, XU Shan-sen1, LIU Chang-wen2, YANG Fan1, CHEN Ya-nan1, ZHAO Li-mei1Δ

(1.Department of Pharmacy, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, China; 2.Northeast Pharmaceutical Group Shenyang NO.1 Pharmaceutical CO., LTD, Shenyang 110869, China)

ObjectiveTo investigate the effects of genetic polymorphisms(CYP2C9，CYP2A6 and CYP2B6) on the concentration of Valproic acid in the epileptic children.MethodsA total of 400 cases were collected in our study. PCR, nest-PCR and direct sequencing were applied to identify the frequency of CYP2C9*3,CYP2A6*4 and CYP2B6*6. One-way ANOVA was used to analyze the influence of the SNPs on CDRVPA.ResultsThe frequencies of allele CYP2C9*3，CYP2A6*4，CYP2B6*6 were 2.75%，6.50%，23.00% respectively. The CDRVPAin epileptic children with allele CYP2C9*3 and CYP2A6*4 were significantly higer than that in children with the wild type(P=0.024;P=0.000), there was no significant difference between the epileptic children with allele CYP2B6*6 and wild type(P=0.095).ConclusionThe CDRVPAis affected by the SNPs of CYP2C9*3 and CYP2A6*4. The dosage of VPA in epileptic children with alleles CYP2C9*3 and CYP2A6*4 should be lower in case of adverse reaction.

Valproic acid; CYP450 enzyme; polymorphism; plasma concentration

国家自然基金(81302857)；辽宁省自然科学基金(2013021079)

张媞，女，硕士，研究方向：临床药理学，E-mail：zhangti0801@163.com；肇丽梅，通信作者，教授、博士生导师，研究方向：药物基因组学、药代动力学、体内药物分析学等，E-mail：zhaolm@sj-hospital.org。

R969

A

1005-1678(2016)02-0001-04