茯苓菌种不同保藏法的效果比较

杨 祎　邵晨霞　刘惠知　唐少军　谭明辉　吴胜莲

（湖南省微生物研究院，湖南　长沙　410009）



茯苓菌种不同保藏法的效果比较

杨 祎邵晨霞刘惠知唐少军谭明辉吴胜莲*

（湖南省微生物研究院，湖南长沙410009）

摘 要对茯苓1号和茯苓8号两个菌种的斜面保藏、木屑管保藏和液体石蜡保藏效果作试验比较。结果液体石蜡保藏法保藏茯苓1号可达4年，茯苓8号可达5年；木屑管保藏法保藏茯苓1号可达3年，茯苓8号可达4年；斜面低温保藏方法保藏的2个茯苓菌种均可达1年以上。指出短期保藏菌种可选用斜面低温保藏法，长期保藏可选择液体石蜡保藏法或木屑管保藏法。

关键词茯苓菌种；斜面保藏；木屑管保藏；液体石蜡保藏；时间

茯苓是最早纳入《中国药典》的药用食用菌之一，具有健胃、祛湿、健脾、安神、增强免疫力、抗癌等功效。据统计目前中药配方中茯苓配伍率达80％。近年来茯苓已广泛应用于医药、保健品和食品领域。我国湖北、湖南、安徽、云南和福建等地都有较大种植规模，茯苓产量也不断增加。茯苓优良菌种是栽培生产的基础和关键，但目前国内推广的茯苓菌种来源单一，长期使用导致退化严重，直接影响产量和质量。目前食用菌的菌种保藏常用斜面法、甘油法、木屑管法、矿物油法、冷冻干燥法、液氮保藏法等［1］，每种菌种保藏方法都有其优点和缺点。本研究通过对茯苓菌种的斜面、木屑管、液体石蜡保藏效果进行比较，旨在找出易操作的适合茯苓菌种保藏的方法，为茯苓菌种的生产和栽培提供基础保障。

1　材料与方法

1.1供试菌种

茯苓1号由华中农业大学菌种中心提供，茯苓8号由湖南靖州茯苓菌核分离获得，湖南省微生物研究院菌种保藏中心保藏。

1.2试验方法

（1）斜面保藏法。斜面菌种培养基配方：马铃薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，琼脂18 g，水1 000 mL，自然pH。培养基注入玻璃试管，试管口加棉塞，121℃灭菌20 min，60℃烘干棉塞后摆斜面，长度为1/3试管高，接种茯苓菌种，26℃培养，待菌丝长满斜面，塞子换成已灭菌的橡皮塞，固体石蜡封口，再用塑料薄膜包封，4℃保藏。

（2）木屑管保藏法。木屑管菌种培养基配方：木屑1 000 g，麸皮200 g，蔗糖5 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸镁0.25 g，含水量60％。培养基装入玻璃试管，容量为管高的2/3，保持培养基松紧适中，擦净管口塞紧棉塞，用牛皮纸包扎管口后121℃高压灭菌60 min，60℃烘干棉塞，接种茯苓菌种，26℃培养，待菌丝长1/2管时，塞子换成已灭菌的橡皮塞，固体石蜡封口，再用塑料薄膜包封，4℃保藏。

（3）液体石蜡保藏法。取化学纯的液体石蜡装于试管，加棉塞，瓶口包牛皮纸，121℃高压灭菌60 min，取出置140℃烘箱中3 h，除去液体石蜡的水分。将上述液体石蜡冷却至室温，加入培养好的茯苓斜面菌种试管，液面高出培养基1 cm，塞子换成已灭菌的橡皮塞，用石蜡封口，再用塑料薄膜包封，直立于试管架，4℃保藏。

（4）茯苓菌丝萌发情况测定。对 3种方法保藏的2个茯苓菌种，在保藏5年期间每年进行测试，将菌种接至斜面，26℃培养，观察菌丝是否萌发，设4个重复。

（5）菌丝生长特性研究。对 3种方法保藏的2个茯苓菌种，在保藏期间的第1周、1年、2年、3年分别进行测试，设4个重复。菌种转接至9 cm玻璃平皿，菌块接种在正中央，26℃培养，待处理长满培养皿时测定各处理菌丝直径，观察菌丝长势，计算菌丝日均生长速度。日均生长速度（cm/d）=菌丝直径/培养天数。

（6）菌丝酯酶同工酶试验。对 3种方法保藏1年的2个茯苓菌种，取培养皿培养的菌丝0.5 g，液氮研磨后加入0.5 mL磷酸缓冲液（pH 7.5），4℃，10 000 r/min离心10 min，取上清液，进行酯酶同工酶电泳试验。方法参考文献［2］，采用聚丙酞胺凝胶电泳，点样量20 μL，电泳结束后摄像分析。

2　结果与分析

2.1不同保藏方法、时间的茯苓菌种萌发情况

菌种保藏1年，茯苓1号和茯苓8号的斜面、木屑管和液体石蜡保藏菌种，接种新斜面后菌丝能正常萌发（表1）。保藏2年，斜面保藏菌种接种新斜面后不能萌发，表明斜面保藏茯苓菌种的期限在1～2年之间。保藏3年后，木屑管和液体石蜡保藏茯苓1号和茯苓8号均萌发。茯苓1号菌种保藏第4年，木屑管菌种未萌发，液体石蜡菌种保藏第5年菌丝仍萌发，说明1号菌种木屑管保藏时间为3～4年，液体石蜡可保藏5年以上。茯苓8号菌种保藏第4年，木屑管和液体石蜡保藏的菌种均萌发；保藏第5年，木屑管和液体石蜡保藏的菌种均未萌发。两个菌种测试结果表明，木屑管保藏茯苓菌种可达3年以上，液体石蜡保藏茯苓菌种至少可达4年。

表1　不同保藏方法、时间的茯苓菌种菌丝萌发情况

表2　不同保藏方法、时间的茯苓菌种菌丝长势和日均生长速度

2.2不同保藏方法、时间的茯苓菌种生长特性

不同保藏方法、时间茯苓菌种菌丝生长特性试验表明（表2），菌种保藏1周，三种保藏方法的菌丝日均生长速度较快，达1 cm以上，长势旺盛，其中液体石蜡的菌丝萌发晚，日均生长速度稍慢。茯苓1号和茯苓8号菌种保藏1年后，菌丝生长速度以木屑管保藏种较快，日均分别为1.12 cm和1.09 cm，菌丝长势旺盛；斜面和液体石蜡保藏种菌丝生长速度较慢，长势一般，与保藏1周的相比菌丝生长速度有所减慢。茯苓1号和茯苓8号菌种保藏2年，木屑管保藏菌种菌丝日均生长速度高于液体石蜡保藏菌种，菌丝长势较好，液体石蜡菌种长势一般。保藏3年后，木屑管和液体石蜡保藏菌种的日均生长速度接近，菌丝长势都较弱。茯苓1号和茯苓8号菌种菌丝生长特性表现趋势为：菌种保藏时间越长，菌丝生长速度越慢；同时期木屑管菌种比液体石蜡保藏种的菌丝生长速度快，长势好，原因可能是由于液体石蜡粘在菌块上，在一定程度上影响菌丝的萌发和生长。

2.3不同保藏方法茯苓菌种菌丝酯酶同工酶谱

茯苓菌种保藏1年菌丝酯酶同工酶谱带分析结果（图1），茯苓1号和茯苓8号2个菌种的谱带基本相同，均为4条，两边2条谱带颜色深且较宽，中间2条谱带颜色浅且窄。

3种菌种保藏方法的菌丝谱带相比，斜面和木屑管保藏种的菌丝颜色和宽窄基本相同，液体石蜡保藏菌种的颜色较浅，尤其是茯苓8号，液体石蜡保藏菌种明显比另外2种保藏法的谱带窄，颜色浅。

图1　2个茯苓菌种菌丝酯酶同工酶谱带及模式图

3　讨论

食用菌菌种在长期保藏中不可避免地出现退化、染杂等情况。因此应依据实际情况、针对保藏目的合理选择保藏方法。Ryan研究发现，对于同一种的不同菌株来说，同一保藏方法处理得到的保藏结果可能不一样［3］。本研究茯苓1号菌种液体石蜡保藏5年萌发，茯苓8号未萌发；茯苓8号木屑管保藏4年萌发，茯苓1号未萌发，两菌种不同保藏方法的效果存在差异。周龙洋等研究认为石蜡油保藏法对菌丝活力有影响，但适合长时间保藏，反复转接2～3次便可得到活力较好的菌丝［4］。本研究结果证明，液体石蜡保藏茯苓菌种时间长，但保藏1年菌丝长势不如斜面保藏和木屑管保藏法，并且保藏1年酯酶同工酶活性也较低。斜面低温保藏法比较适合大型真菌的短期保藏，操作简单，茯苓栽培基地用于生产的常规菌种可选这种保藏方法。李羿等研究认为，斜面保藏法需4～6个月转接一次［5］，频繁转接发生变异的几率较高，真空冷冻干燥保藏法适合茯苓母种的长期保藏，但设备和技术要求均较高。专业的菌种保藏中心需要根据不同的菌种，选择两种以上的保藏方法，木屑管保藏茯苓菌种可作为备选。对于获得的野生菌株，应尽量减少传代次数，较好保藏其基因型等信息，有条件选择超低温保藏，可酌情选择液体石蜡保藏法。

根据茯苓1号和8号菌种保藏1年酯酶同工酶试验结果，2个菌种的酶谱带相同，可能两菌种遗传关系相近或相同。由于我国茯苓菌种遗传背景单一，很有可能是同种异名情况。有研究利用比较SRAP分子标记技术对国内的大部分主要栽培品种茯苓种质资源进行亲缘关系评价，结果表明供试的主要栽培品种间整体亲缘关系较近［6］。张金霞等研究认为酯酶同工酶谱是鉴定草菇菌种保藏效果的可利用的生化标志［2］。本研究 3种保藏方法保藏1年菌丝酶谱相同，可能是因未改变菌种的遗传特性，但未开展保藏1年之后的验证试验。因此保藏若干年后是否发生遗传特性改变尚待进一步研究。

参考文献

［1］孔维丽，袁瑞奇，孔维威，等.食用菌菌种保藏历史、现状及研究进展概述［J］.中国食用菌，2015，34（5）:1-5.

［2］张金霞，张树庭.草菇菌种保藏效果鉴定的研究［J］.中国食用菌，1992，11（4）:3-9.

［3］Ryan，M.J..The effect of preservation regime on the physiology and genetic stability of economically important fungi［D］.University of Kent，1999.

［4］周龙洋，霍光华，罗贵祥，等.3种保藏方法对66种大型真菌活力影响［J］.生物灾害科学，2013，36（2）:130-136.

［5］李羿，万德光.茯苓菌种保藏的研［J］.药生物技术，2010，17（6）:516-518.

［6］蔡志欣，蔡丹凤，陈美元，等.32个茯苓菌株的SRAP分析［J］.食药用菌，2013，21（2）:96-98.

中图分类号：S567.3+1

文献标识码：A

文章编号：2095-0934（2016）03-176-04

作者简介：杨祎，助理研究员。E-mail：52073200@qq.com

*通讯作者：吴胜莲，高级农艺师。E-mail：648289145@qq.com