肝素样品前处理方法比较及荧光定量PCR法鉴定肝素原料种属来源

周朝东，白海娇，黄哲

(天津市药品检验所，天津 300070)

肝素样品前处理方法比较及荧光定量PCR法鉴定肝素原料种属来源

(天津市药品检验所，天津 300070)

目的 比较肝素原料的3种前处理方法，即磁珠吸附法、琼脂糖凝胶回收法和肝素酶降解法的优劣，并对肝素原料的种属来源进行鉴别。方法 分别用磁珠提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒和肝素酶对肝素原料进行前处理，用商业化的猪、牛、羊种属鉴别试剂盒进行检测。采用荧光定量PCR法对3批肝素原料进行种属来源的鉴别，同时对猪源肝素中掺入的不同比例羊源肝素进行检出限的检测。结果 3种不同的前处理方法以肝素酶降解法最快捷、最省时和最经济；种属来源鉴别结果准确。荧光定量PCR法检测猪源肝素中掺入羊源肝素的检出限是0.01%。结论 肝素酶降解法能简捷、快速、经济的解决肝素原料中样品前处理的技术难点，结合商业化的猪、牛、羊鉴别试剂盒与荧光定量PCR仪能够简便、快速、准确的对肝素原料种属来源进行鉴别。

磁珠提取；琼脂糖凝胶电泳；肝素酶；荧光定量PCR；肝素原料；种属鉴别；质量控制

肝素是一种抗凝剂，最早发现于肝脏，因此命名为肝素。它主要分布于哺乳动物的肺、肝、小肠黏膜细胞内，此外，在心、胰脏、胎盘、血液等也有分布[1-2]。肝素是一类糖胺聚糖，是由糖醛酸和葡萄糖胺以1→4键连接的重复二糖单位组成的多糖链复合物，含10～30个二糖单位，分子量4000～20000，平均分子量约为12000[3]。普通肝素又称未分级肝素或标准肝素，以其为母体开发了各种衍生物如低分子肝素、超低分子肝素以及标准肝素的修饰物等，广泛应用于临床[4]。肝素的制备过程主要分为2个阶段，即粗品的生产和精制。粗品的生产主要是采用离子交换树脂法，有的还结合超滤技术进行除杂和浓缩。精制过程主要是去除杂质和脱色[5]。肝素是一类分子结构复杂的化合物，目前难以在短期内通过化学合成。中国的生猪屠宰量占全球50%以上，是全球粗品肝素和肝素原料药的主要生产国，也是全球最大的肝素原料出口国[2]。猪源肝素与人肝素结构相同，不会产生蓄积毒性，有报道显示，牛来源的肝素引起人血小板减少的不良反应是猪源肝素的2倍[4]，同时反刍动物会感染疯牛病和疯羊病，因此肝素来源以猪肠粘膜为最佳。

荧光定量PCR以其快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、可实时监测、全封闭反应等优点已经在生物安全性和生物技术产品的遗传稳定性评价方面有很多应用[6-7]。目前已经有文献[8-13]和行业标准[14]报道用PCR和荧光定量PCR对肝素原料进行种属来源的鉴别，鉴别的难点主要集中在样品的前处理，因为肝素是多糖类物质，会严重抑制后续PCR的反应。本文旨在比较磁珠吸附法[10]、琼脂糖凝胶电泳回收法[12]、肝素酶降解法[13]这3种样品前处理方法的优劣，并采用荧光定量PCR对肝素原料进行种属来源的鉴别，以期为药品生产企业和药品检验部门提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 材料：3批猪源粗品肝素原料由天津红日药业有限公司提供，批号分别为：20140205，20140514-1，20140514-2。3批精品肝素由天津生物化学制药有限公司提供，批号分别为：01091106、01091109、01091201。1批羊源肝素由天津生物化学制药有限公司提供，批号为Y1307009-1。猪、牛、羊基因组DNA提取于的新鲜猪、牛、羊肉(从超市购得)。

1.1.2 主要试剂：血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根公司；磁珠提取和纯化试剂盒(Chargeswitch gDNA Rendered Meat purification kit，Powerclean DNA clean-up kit)购自Invitrogen公司；肝素酶I购自sigma公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒(EZNA Gel Extraction kit)购自omega公司； Gelred染料购自biotium公司；商业化的猪、牛、羊种属鉴别试剂盒购自北京宝科维食安生物技术有限公司，其余试剂为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器：GT-Sub琼脂糖凝胶电泳仪购自美国bio-rad公司；微量紫外可见分光光度计NanoDrop购自美国Thermo公司；Stepone荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 猪、牛、羊标准基因组DNA提取：采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒分别从新鲜猪、牛、羊肉中提取基因组DNA，微量紫外可见分光光度计测定浓度和纯度。

1.2.2 猪、牛、羊基因组DNA标准曲线的制作：用灭菌超纯水以10倍梯度逐级稀释1.2.1提取好的基因组DNA，分别进行荧光定量PCR，以DNA浓度的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标作回归方程，每个浓度做3个重复。

1.2.3 不同比例羊肝素的配制：把粗品羊肝素和粗品猪肝素分别研磨后按重量以不同比例混匀，分别为100%羊肝素、10%羊肝素、1%羊肝素、0.1%羊肝素和0.01%羊肝素。

1.2.4 磁珠吸附法对样品进行前处理：称取粗品肝素约250 mg置2 mL 离心管内，加入1 mL裂解缓冲液涡旋溶解，采用磁珠提取试剂盒提取DNA，并用 DNA纯化试剂盒纯化。

1.2.5 琼脂糖凝胶电泳回收法对样品进行前处理：①配制2%的琼脂糖凝胶。②称取粗品肝素原料约50 mg，加水200 μL涡旋使其溶解，沸水浴中加热10 min，再置冰浴中5 min。③室温10000 g/min离心10 min，取上清液。取20 μL上清液上样电泳。100 V电泳1.5 h。④紫外灯下切下含有DNA的琼脂糖凝胶，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收。

1.2.6 肝素酶降解法对样品进行前处理：①称取300 mg肝素原料置15 mL离心管中，加入10 mL 50 mM Tris-HCl/5mM CaCl2(pH 8.0)溶液，涡旋使其溶解，作为溶液A。②取溶液A 100 μL加入9.9 mL 50 mM Tris-HCl/5mM CaCl2(pH 8.0)溶液使稀释100倍，涡旋混匀，作为溶液B。③取溶液B 200 μL，85 ℃水浴中孵育5 min，冰浴中放置10 min，加入2 μL肝素酶I(含0.2单位的肝素酶I)，30 ℃水浴中消化0.5 h。④取出样品进行PCR实验。

1.2.7 荧光定量PCR鉴定肝素种属来源：PCR反应体系及程序设置：2×Master Mix 10 μL，上下游引物预混液4 μL，探针2 μL，模板DNA 1 μL，无RNase的水 3 μL，总反应体系共20 μL。程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，共40个循环。结果判断标准：若样品有典型扩增曲线且Ct<30，则为阳性结果；若样品有典型扩增曲线且30≤Ct≤34，则结果可疑，加大模板量或重新提取核酸再次实验；若样品无典型扩增曲线或Ct>34，则为阴性结果。每个样本重复3次。同时设置阴性对照和阳性对照，阴性对照以水替代模板，其余不变，扩增Ct>34或者无典型扩增曲线即可。阳性对照以标准基因组DNA作为扩增模板，有典型扩增曲线且Ct<20有效。

2 结果

2.1 3种标准基因组DNA的浓度和纯度 测定结果显示，猪基因组DNA浓度为99.7 ng/μL，纯度A260/A280为1.86；牛基因组DNA浓度为150.1 ng/μL，纯度A260/A280为1.83；羊基因组DNA浓度为64.0 ng/μL，纯度A260/A280为1.85。

2.2 q-PCR标准曲线及线性回归方程 猪基因组DNA浓度在997 fg/μL～99.7 ng/μL范围内其Ct值与模板DNA浓度的对数值呈良好线性关系，线性回归方程为：y=-3.2064x+41.037，相关系数r为0.996。扩增效率E=105%，定量限约为997fg，检出限约为9.97fg。

牛基因组DNA浓度在1.5 pg/μL～150.1 ng/μL范围内其Ct值与模板DNA浓度的对数值呈良好线性关系，线性回归方程为：y=-3.8664x+43.462，相关系数r为0.999。扩增效率E=81%，定量限约为1.5 pg，检出限约为15 fg。

羊基因组DNA浓度在640 fg/μL～64 ng/μL范围内其Ct值与模板DNA浓度的对数值呈良好线性关系，线性回归方程为：y=-3.7278x+41.36，相关系数r为1。扩增效率E=86%，定量限约为640 fg，检出限约为0.64 fg。

2.3 对3种前处理方法得到的肝素样本进行q-PCR检测

2.3.1 磁珠吸附法实验结果：3批粗品肝素中只含有猪源性成分，不含有牛、羊源性成分。见表1。

表1 磁珠吸附法提取粗品肝素的q-PCR结果Ct值

2.3.2 琼脂糖凝胶电泳回收法实验结果： 3批粗品肝素中只含有猪源性成分，不含有牛、羊源性成分。见表2。

表2 琼脂糖凝胶电泳回收法提取粗品肝素的q-PCR结果Ct值

2.3.3 肝素酶降解法实验结果： 3批粗品肝素中只含有猪源性成分，不含有牛、羊源性成分。见表3。

表3 肝素酶降解法处理的粗品肝素q-PCR结果Ct值

2.4 琼脂糖凝胶电泳法比较精品肝素与粗品肝素的差别 按方法1.2.5中的琼脂糖凝胶电泳法处理精品肝素和粗品肝素，可以看出粗品肝素中残留有大量的DNA而精品肝素中则无肉眼可见的DNA。见图1。

图1 粗品肝素(左)和精品肝素(右)的琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agrose gel electrophoresis pictures of crude heparin(left) and fine heparin(right)

2.5 3种前处理方法对含不同比例羊肝素结果的比较 掺有不同比例猪肝素的粗品羊肝素，按3种前处理方法进行处理，荧光定量PCR结果显示：磁珠吸附法ΔCt范围从0.79～1.69；肝素酶降解法ΔCt范围从3.21～3.98；琼脂糖凝胶电泳回收法ΔCt范围从1.91～4.58；表明肝素酶降解法的ΔCt值比其他2种前处理方法得到的ΔCt值相对均一，效果最好。见表4。

表4 不同比例羊肝素经3种前处理方法的PCR结果

3 讨论

实验结果显示：3种前处理方法都能得到理想的实验结果，且猪源鉴别试剂盒扩增粗品肝素的Ct值均在20左右。从操作步骤上看，磁珠吸附法(53个操作步骤)最多，其次是琼脂糖凝胶回收法(21个操作步骤)，最少的是肝素酶降解法(6个操作步骤)。从时间上看，肝素酶降解法最省时，半天即可完成整个实验，而磁珠吸附法和琼脂糖凝胶电泳回收法则最少需要一天时间。从实验成本看，耗费最多的是磁珠吸附法，约100元/样品，其次是琼脂糖凝胶电泳回收法，约15元/样品，最后是肝素酶降解法，约8元/样品。从操作难易程度，笔者认为琼脂糖凝胶回收法较难，涉及到制胶、上样、切胶等步骤，其次是磁珠吸附法，最简单的是肝素酶降解法。综合考虑，肝素酶降解法不仅省时省力，也比较经济，适合大批量粗品肝素的检测。

文献报道[12]加入肝素酶的量为2个单位，消化时间18 h，本实验考查了不同肝素酶量(0.2单位和0.5单位)和不同消化时间(0.5、2、4、6、24 h)对实验结果的影响，发现在样品溶液加入0.2单位的肝素酶消化0.5 h即可有效去除肝素的抑制作用(结果未显示)。

对3批粗品肝素进行种属来源的鉴别，均鉴定正确，但用3种前处理方法对企业提供的精品肝素进行种属来源的鉴别未得到理想结果，可能粗品肝素在精制过程中其残留的DNA已被破坏殆尽(与琼脂糖凝胶电泳结果一致)。另从2者外观亦可以看出区别，粗品肝素有微小颗粒，颜色呈淡黄褐色，而精品肝素则是细粉呈白色。

综上所述，通过比较3种前处理方法，以肝素酶降解法最简单、最省时、最经济，适合于药企和药品检验部门对肝素样品的质量控制。

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(编校：吴茜)

Comparison of crude heparin pretreatment methods and identification of crude heparin from various species origins by quantitative PCR

ZHOU Chao-dong, BAI Hai-jiao, HUANG Zhe-suΔ

(Tianjin Institute for drug control, Tianjin 300070, China)

ObjectiveTo compare magnetic beads kit，agrose gel recovery kit and heparinase I three methods to purify the micro DNA from crude heparin, then use q-PCR to identify the species origins and select the best method.MethodsUsing magnetic beads kit，agrose gel recovery kit and heparinase I to purify micro DNA from crude heparin and combined the porcine，bovine and ovine identification kits to identify the species origins and conformed the minimum detection limit of different percentage of ovine crude heparin in porcine crude heparin.ResultsThree pretreatment methods all can solve the pretreatment difficulties and we found that the haparinase was the best method; the minimum detection limit was 0.01%of ovine crude heparin in porcine crude heparin.ConclusionThe heparinase method is the best pretreatment method and can successfully solve the pretreatment difficulties.Heparinase combine the porcine， bovine and ovine identification kits can identify the species origins from crude heparin.

magnetic beads; agrose gel electrophoresis; heparinase; quantitative PCR; crude heparin; species identification; quality control

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.60

周朝东，男，硕士，主管药师，研究方向：生化药品检验与研究，E-mail：zhouchaodong0517@163.com；黄哲甦，通信作者，女，主任药师，研究方向：生化药品检验与研究，E-mail：zcd82@163.com。

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