红鳍东方鲀FoxO1基因的原核表达及纯化

张伟，李翠萍，杨志军，何广杰

（新乡医学院 a.基础医学院；b.法医系，河南 新乡453003）

红鳍东方鲀FoxO1基因的原核表达及纯化

张伟a，李翠萍a，杨志军a，何广杰b*

（新乡医学院 a.基础医学院；b.法医系，河南 新乡453003）

摘 要：采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总RNA，采用RT-PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀FoxO1基因的ORF，并构建其原核表达载体pET-32/FoxO1，在大肠杆菌Rosetta （DE3）进行表达，通过IPTG诱导表达，对重组FoxO1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定，结果表明：重组质粒pET32a/FoxO1被成功构建；用IPTG进行诱导表达，融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在，能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应；纯化出了融合表达蛋白，获得了相对分子质量约为110 000的重组蛋白。

关 键 词：红鳍东方鲀；FoxO1基因；原核表达；蛋白纯化

投稿网址：http：//xb.ijournal.cn

目前，无论在人类医学还是在农业动物生物学领域，关于脂肪组织发育及其调控的研究均备受瞩目。鱼肉的品质及脂肪沉积调控成了水产学科研究中的重要内容。脂肪代谢在分子水平上是受关键基因和酶调控的。Forkhead转录因子来源于果蝇的“叉头”突变，又称为Fox基因。该基因在酵母和真核细胞生物中广泛存在。Fox基因含有17个亚家族，其中对FoxO家族的研究最为深入［1］。哺乳动物中FoxO家族中有 4个转录因子，分别为 FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6［2］。FoxO1是FoxO亚家族中的主要成员之一，可能通过多条通路来调控细胞的增殖与分化［3-4］、凋亡［5］、细胞周期［6］、葡萄糖代谢［7］以及脂肪代谢［8-9］等。FoxO1是胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路中重要的转录因子，通过调节下游的靶基因来调节脂肪代谢等［10］。FoxO1基因能够抑制前体脂肪细胞的增值分化，从而使脂肪的形成减少［11］。FoxO1能够抑制PPARγ功能复合体与DNA的结合［12］。Fajas等［13］发现FoxO1可能通过抑制PPARγ、p21及p27等的下游靶基因表达来减少脂肪生成。FoxO1也可以通过抑制MyoD来阻碍

1 材料与方法

1.1 材料

采用红鳍东方鲀作为试验样本。取红鳍东方鲀的脂肪组织，用灭菌DEPC处理水冲洗组织样，在液氮速冻1 h后取出，置于－80 ℃冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 红鳍东方鲀FoxO1基因的鉴定

本试验以斑马鱼 FoxO1的氨基酸序列（NP_001070725.2）为探针，对红鳍东方鲀基因组数据库（http：//genome.jgi-psf.org/Takru4/Takru4.home. html）进行 BLAST分析，以获得新的红鳍东方鲀FoxO1 cDNA序列。

1.2.2 FoxO1基因的克隆

利用Trizol试剂（Invitrogen，美国）抽取脂肪组织总RNA。以总RNA为模板，利用SuperScript Ⅲreverse transcriptase（Invitrogen Corp，Carlsbad，CA，美国）合成cDNA第一链。根据预测的FoxO1基因序列，在ORF区两端设计引物（上游引物为5'-ATGGCGGAAGCAGCCCA-3'；下游引物为5'-CCCTG ACACCCAGCTGTGC-3'）。RT-PCR反应扩增条件为：94 ℃变性30 s，60 ℃退火40 s，72℃延伸 2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。利用T-A克隆将PCR产物于pGEM T-easy载体（Promega，USA）进行相连，连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，在含Amp、X-gal和IPTG的LB平板上初步筛选阳性克隆。菌落PCR鉴定阳性克隆，选择3个阳性克隆送Invitrogen（上海）公司进行测序。

1.2.3 原核表达载体的构建及鉴定

根据克隆得到的红鳍东方鲀cDNA FoxO1的ORF序列设计特异引物（上游引物P1为5′-CGGAA TTCEcoRⅠATGGCGGAAGCAGCCCA-3′；下游引物P2为5′-CCGCTCGAGXhoⅠCCCTGACACCCAGCT GTGC-3′），引物对的划线部分分别为EcoRⅠ酶切位点和XhoⅠ酶切位点。RT-PCR反应体系：cDNA模版1.0 μL，10 μmol/L P1 1.0 μL，10 μmol/L P2 1.0 μL，10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 2.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L） 2.0 μL，ddH2O 17.0 μL，1 U/μL KOD- Plus-Neo高保真DNA聚合酶 0.5 μL，总计25 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，61 ℃复性50 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR电泳回收产物与克隆载体pGEM T-easy （Promaga公司）连接，并转化入大肠杆菌感受态细胞JM109，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，通过蓝白斑法筛选阳性克隆，并进行质粒抽提。将得到的FoxO1基因克隆质粒与pET32a质粒同时用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切3 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段和载体，并利用T4 DNA连接酶进行连接后转化到大肠杆菌JM109。随机挑选克隆进行菌落PCR和双酶切鉴定，并对阳性克隆进行增菌培养，抽提质粒，送Invitrogen（上海）公司进行测序验证。

1.2.4 重组质粒pET32a/FoxO1的诱导表达

对经pET32a/FoxO1测序鉴定正确的重组质粒转化到Rosetta（DE3）大肠杆菌中，在平板上随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定，将鉴定结果为阳性克隆的接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基，在37 ℃过夜振荡培养后，按1∶50转接到20 mL同样的培养基中振荡培养至OD值为0.8，取出5 mL菌液作为未诱导对照，其他加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37℃诱导5 h后离心，收集菌体，装菌体放入冰上，利用超声波进行破碎，10 000 ×g 4 ℃离心20 min后将上清液转到新离心管，把PBS缓冲液加到沉淀组分中充分悬浮振荡。将样品加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液后煮沸裂解5 min。利用SDS-PAGE电泳技术检测目的蛋白的表达。

1.2.5 目的蛋白的纯化与Western Blot检测

使用镍柱纯化上清部分，先上低盐缓冲液平衡柱材，再用上清液上柱，重悬柱材，冰浴30 min，弃去流出液，用15倍柱体积低盐缓冲液洗脱，10倍柱体积高盐缓冲液洗脱，5倍柱体积低盐缓冲液洗脱，2倍柱体积洗脱液洗脱，收集样品液，纯化结果用SDS-PAGE检测。

从SDS-PAGE胶上切下需要转膜的部分，用纯水进行冲洗。将滤纸剪成与胶大小相当，共剪6张，同时也将PVDF膜剪成和胶大小相当。在转移缓冲液中把PVDF膜与滤纸浸没平衡10 min。按照滤纸、胶、PVDF膜、滤纸的顺序从负极到正极摆放，连接电源。将凝胶面积按0.8 mA/cm2接通电流，电转移1.5 h后将电源关掉，将PVDF取出后放进塑料袋，加封闭液和1∶1 000稀释的Anti-His Antibody（GE Healthcare 公司），封口。37 ℃摇床中温育1 h后取出PVDF膜，先用纯水冲洗，再用TBST漂洗3次，每次10 min。将PVDF膜放入内加封闭液和经1∶2 000稀释的HRP标记羊抗鼠酶标二抗塑料袋进行封闭，摇床中37 ℃温育1 h后取出PVDF膜，用PBS漂洗3次，ECL显色，暗室曝光，观察结果。

2 结果与分析

2.1 pET32a/FoxO1重组表达载体的构建

红鳍东方鲀脂肪组织中提取的总RNA经RT-PCR扩增后，可获得约2 049 bp的条带，条带符合预期大小。测序结果显示，此序列全长2 049 bp。图1中1条为载体，1条为目的条带。测序结果表明，所测序列没有碱基缺失及变异，可初步确认所构建的pET32a/FoxO1重组表达质粒是成功的，可以进行后续试验。

图1 重组质粒pET32a/FoxO1的酶切分析结果Fig.1 Restriction analysis on recombinant plasmid of pET32a/FoxO1

2.2 pET–32a/FoxO1重组表达与纯化的融合蛋白

将pET-32a/FoxO1转化到大肠杆菌Rosetta （DE3），与诱导前相比，经IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳图谱中增加了大小约110 000的蛋白条带，其相对分子质量与推测融合蛋白的相当，而转入空质粒pET32a的阴性对照在诱导前后均未见相应的蛋白条带（图2）。表达的目的蛋白主要以可溶蛋白形式存在，在沉淀中含有部分目的蛋白。试验结果可初步证实FoxO1已在大肠杆菌中获得成功表达。该试验3次重复试验的SDS-PAGE电泳结果基本一致。

图2 重组质粒表达产物的SDS–PAGE分析结果Fig.2 SDS–PAGE analysis on expression products of FoxO1 in Rosetta (DE3)

2.3 Western Blot分析结果

由图3可知，经pET32a/FoxO1重组质粒诱导及纯化后，检测到1条相对分子质量约110 000的蛋白条带，这进一步证实纯化蛋白为含6-His标签的红鳍东方鲀FoxO1融合蛋白。

图3 目的蛋白的Western Blot检测结果Fig.3 Identification results via Western Blot on FoxO1

3 结论与讨论

FoxO1是参与哺乳动物脂肪代谢过程的重要的转录因子，通过多条信号转导通路参与脂肪细胞的增殖、分化与凋亡。目前已发现FoxO1存在于哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类等多种脊椎动物中，生物信息学分析发现鱼类 FoxO1序列与陆上动物既具有相似的保守结构特征，也具有不同的结构特征，提示 FoxO1在鱼类和陆上动物的脂肪代谢中可能发挥着不同的调节作用。在大肠杆菌表达菌株中表达外源重组蛋白是目前应用较多的研究方法，其遗传背景研究较为清楚，因此，应用较为广泛。目前常用的蛋白质标签有 GST-tag、His-tag、HSV-tag 及Flag-tag等。因为pET系统所带标签小，纯化方便，不影响蛋白质的活性，pET-32a（+）表达载体的N端含有编码6个组氨酸标签（6×His-Tag）的序列，所以，用其进行重组蛋白鉴定和纯化较为方便［16-17］。成功获得重组蛋白原核表达的关键因素有表达菌株基因型、诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等。IPTG为本研究中所选用的诱导剂，其浓度过低会因为刺激不够而使重组蛋白的表达量不足；浓度过高会因为毒性较大而导致重组蛋白表达量减少。诱导温度的高低及时间的长短主要决定细菌的生长速率，从而影响蛋白质的外源表达。外源重组蛋白质的原核表达一般选择在合适温度进行5 h左右的诱导。

为了在体外进一步研究红鳍东方鲀 FoxO1基因的功能，将红鳍东方鲀FoxO1基因克隆到原核表达载体 pET-32a，成功构建了重组表达质粒pET-32a/FoxO1。将重组质粒转化到 Rosetta（DE3）大肠杆菌中，利用IPTG进行诱导表达，菌液上清液中的表达量较多。将上清液过镍柱进行纯化，用盐溶液进行洗脱，利用SDS-PAGE电泳和Western Blot技术进行鉴定，发现纯化后蛋白质的相对分子质量约为110 000，表明所得到蛋白为带6个His 的FoxO1融合蛋白质。pET-32a/FoxO1重组质粒的构建及FoxO1融合蛋白的成功表达，可为抗体制备及FoxO1蛋白功能的深入研究，尤其为鱼类脂肪代谢作用的研究提供参考依据。

参考文献：

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责任编辑：王赛群

英文编辑：王 库

中图分类号：S917；Q786

文献标志码：A

文章编号：1007-1032（2016）01-0081-04

收稿日期：2015-05-13 修回日期：2015-12-25

基金项目：河南省科学技术厅科技攻关计划项目（122102310196）；河南省教育厅自然科学研究计划项目（12A150019）

作者简介：张伟（1977—），男，河南长垣人，博士，主要从事基因调控机制研究，zhangwei0920@163.com；*通信作者，何广杰，副教授，博士，主要从事化学生物学研究，guangjiehe@163.com骨骼肌的分化［14-15］。目前，关于鱼类FoxO1基因的研究尚少。红鳍东方鲀是一种模式生物，其肉质鲜美，营养丰富，也是中国沿海地区养殖的主要鱼种之一。本研究中以红鳍东方鲀为研究对象，研究其FoxO1基因的原核表达及纯化，现将结果报道如下。

Prokaryotic expression and purification of FoxO1 gene from torafugu Takifugu rubripes

Zhang Weia，Li Cuipinga，Yang Zhijuna，He Guangjieb*
（a.School of Basic Medical Science； b.Department of Forensic Medicine， Xinxiang Medical University， Xinxiang，Henan 453003， China）

Abstract：The ORF of FoxO1 gene was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） from total RNA extracted from adipose tissues of torafugu Takifugu rubripes. PET-32a/Sirt1，the prokaryotic expression vector，was constructed and transformed into Escherichia coli Rosetta （DE3） for FoxO1 expression. Through IPTG inducting expression，the induced fusion protein was purified and verified by SDS-PAGE and Western Blot. As a result，the full-length open reading frame of torafugu FoxO1 cDNA was successfully cloned，and the recombinant vector was constructed. The expressed fusion proteins induced by IPTG were soluble protein. The fusion proteins with tag His were also purified，and the molecular weight of the recombinant protein was about 110 000.

Keywords：Takifugu rubripes； FoxO1 gene； prokaryotic expression； protein purification