布鲁氏菌病患者外周血树突状细胞、Th1/Th2细胞因子含量的检测及意义

古玉茹　刘颖翰　石栓柱　陈翛然　孔素花　温占平　冯敬国



·论著·

布鲁氏菌病患者外周血树突状细胞、Th1/Th2细胞因子含量的检测及意义

古玉茹刘颖翰石栓柱陈翛然孔素花温占平冯敬国

075000河北省张家口市传染病医院传染一科

【摘要】目的观察布鲁氏菌病患者外周血树突状细胞表型、Th1/Th2细胞含量的检测及意义。方法选取诊治的布鲁氏菌病患者50例为病例组，另选取同期进行健康体检的正常人50例作为正常组。采用Real time-PCR测定2组Th1相关转录因子T细胞表达的T盒(T-bet)、GATA 连接蛋白3(GATA-3)、维A酸相关核孤儿受体γt(RORγt)、叉头蛋白3(Foxp3)及Th1/Th2细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)mRNA含量。酶联免疫吸附实验(ELISA)测定TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10蛋白表达及补体C3、C4含量。流式细胞术测定树突状细胞表型、Th1、Th2及T淋巴细胞亚群细胞细胞、NK细胞)含量。结果病例组外周血Th1细胞相关转录因子T-bet、RORγt、Foxp3及Th1细胞、Th1/Th2、TNF-α、IFN-γ含量较对照组显著降低，Th2细胞及IL-6、IL-10含量较对照组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；病例组阳性的树突状细胞比例细胞、NK细胞及补体C3、C4含量较对照组显著降低，细胞含量较对照组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；TNF-α、IFN-γ含量与细胞、NK细胞、C3、C4含量呈正相关性(r值分别为2.879、3.214、3.255和2.978，P<0.05)，与细胞含量呈负相关性(r值分别为-3.146和-3.011,P<0.05)。IL-6、IL-10含量与细胞、NK细胞、C3、C4含量呈负相关性(r值分别为-2.124、-2.343、-3.423、-2.789、-2.993、-2.566、-3.758，P<0.05)，与细胞含量呈正相关性(r值分别为3.465、3.129,P<0.05)。结论布鲁氏菌病患者外周血成熟树突状细胞数目减少，同时Th1/Th2细胞及相关细胞因子失衡，且与机体天然免疫和细胞免疫功能降低有关，这可能在布鲁氏菌病发生发展过程中发挥重要作用。

【关键词】布鲁氏菌病；树突状细胞；Th1/Th2细胞因子；天然免疫；细胞免疫

布鲁氏菌病又称波状热、地中海弛张热，该病是通过不同方式接触了感染布鲁氏菌的牲畜分泌物、排泄物或吸入污染的空气、尘埃而引起的传染-变态反应性人畜共患传染病。布鲁氏菌感染后可侵犯全身各器官和组织出现增生性炎性病变，患者主要表现为发热、乏力、关节和肌肉疼痛等症状，若治疗不及时病情易迁延不愈，遗留后遗症，严重者甚至丧失劳动力[1,2]。近年来，布鲁氏菌病发病率有逐年上升趋势，尤其好发于西部畜牧业经济发达地区，对患者生命健康和社会经济发展均产生严重影响。目前，布鲁氏菌病的发病机制尚未阐明，但已有研究表明免疫功能紊乱在该病发生发展中发挥重要作用[3]。本研究通过检测布鲁氏菌病患者外周血树突状细胞表型、Th1/Th2细胞因子含量及与机体免疫功能的关系，旨在为阐明布鲁氏菌病的发病机制提供实验依据。

1资料与方法

1.1一般资料选取2014年10月至2015年10月我院收治的布鲁氏菌病患者50例(病例组)为研究对象，其中男42例，女8例；年龄15～69岁，平均年龄(45±7)岁，均符合国家卫生部制定的《布鲁氏菌病诊断标准》[3]：(1)有明确的流行病学接触史；(2)有发热、乏力、肝脾及淋巴结肿大、关节及肌肉疼痛等症状体征；(3)血清凝集实验检测特异性抗体IgA(+)、IgG(+)。50例患者中农牧民43例，其中38例有牧羊史或与牛、羊等牲畜接触史；学生7例，其中5例经常食用牛、羊肉，2例流行病学史不明显。另选取同期于我院进行健康体检的正常人50例作为对照组，其中男38例，女12例；年龄20～68岁，平均年龄(43±7)岁。2组年龄、性别比等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2临床症状50例患者表现为不同程度的发热、乏力、头痛、肌肉关节痛等，其中发热45例(90.00%)，体温37.1～38.0℃者8例(17.78%)，38.1～39.0℃者22例(48.89%)，39.1～41.0℃者15例(33.33%)；关节肌肉痛45例(90.00%)；肝脾肿大17例(34.00%)；睾丸肿大3例(6.00%)。

1.4检测方法

1.4.1外周血单个核细胞的提取:用PBS稀释EDTA抗凝全血，加入淋巴细胞分离液，400 g离心30 min，液体自上而下依次分为4层：血浆层、淋巴细胞单核细胞层、淋巴细胞分离液层、粒细胞红细胞层。用吸管小心吸取淋巴细胞单核细胞层细胞，PBS充分洗涤，100 g离心10 min，弃上清。加入红细胞裂解液重悬细胞，室温避光孵育5 min，100 g离心5 min，弃上清。PBS充分洗涤后重悬细胞，即为外周血单个核细胞(PBMC)。

1.4.2Real time-PCR:Trizol提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书加样进行逆转录反应，ABI 7300型荧光定量PCR仪扩增。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用仪器自带的分析软件得到各样本、各基因扩增的Ct值，以β-actin为内参照基因，目的基因表达相对值RQ=2ΔΔCt。见表1。

表1　Real time-PCR引物序列

1.4.4ELISA实验:采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10及补体C3、C4含量。试剂盒均购自南京建成生物工程技术研究所，严格按照试剂盒说明书操作。

2结果

2.12组转录因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3比较Real time-PCR结果显示，病例组T-bet、RORγt、Foxp3 mRNA表达较对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而GATA-3 mRNA表达较对照组无明显变化(P>0.05)。见表2。

组别T-betmRNAGATA-3mRNARORγtmRNAFoxp3mRNA对照组4.12±0.563.38±0.474.23±0.613.77±0.56病例组1.48±0.20*3.32±0.441.36±0.21*1.12±0.15*

注：与对照组比较,*P<0.05

表3　2组外周血树突状细胞表型比较　±s

注：与对照组比较,*P<0.05

2.32组外周血PBMC Th1、Th2含量比较流式细胞术结果显示，对照组Th1、Th2细胞含量分别为(9.0±1.2)和(7.3±1.0)，Th1/Th2为(1.22±0.19)；病例组Th1、Th2细胞含量分别为(3.8±0.6)和(10.4±1.5)，Th1/Th2为0.36±0.05，病例组Th1细胞含量及Th1/Th2较对照组显著降低，Th2细胞含量较对照组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

组别Th1(%)Th2(%)Th1/Th2对照组9.0±1.27.3±1.01.22±0.19病例组3.8±0.6*10.4±1.5*0.36±0.05*

注：与对照组比较,*P<0.05

2.42组Th1/Th2细胞因子含量比较Real time-PCR和ELISA结果显示，对照组和病例组TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 mRNA含量分别为(1.77±0.23)、(1.36±0.20)、(0.87±0.11)、(0.94±0.15)和(0.46±0.07)、(0.34±0.05)、(1.79±0.25)、(1.92±0.31)，TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10蛋白含量分别为(18.2±2.7)pg/ml、(124±18)pg/ml、(46±7)pg/ml、(31±5)pg/ml和(5.4±0.8)pg/ml、(30±5)pg/ml、(104±16)pg/ml、(100±15)pg/ml，病例组TNF-α、IFN-γ mRNA和蛋白含量较对照组显著降低，IL-6、IL-10 mRNA和蛋白含量较对照组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5、6。

组别TNF-αmRNAIFN-γmRNAIL-6mRNAIL-10mRNA对照组1.77±0.231.36±0.200.87±0.110.94±0.15病例组0.46±0.07*0.34±0.05*1.79±0.25*1.92±0.31*

注：与对照组比较,*P<0.05

组别TNF-α蛋白IFN-γ蛋白IL-6蛋白IL-10蛋白对照组18.2±2.7124±1846±731±5病例组5.4±0.8*30±5* 104±16* 100±15*

注：与对照组比较,*P<0.05

组别CD+4CD+8CD+4/CD+8NK对照组45±522.6±2.62.00±0.3424.2±2.7病例组30±3*30.2±3.4*1.00±0.15*12.5±2.0*

注：与对照组比较,*P<0.05

2.62组补体含量比较流式细胞术结果显示，对照组C3、C4含量分别为(1.28±0.20)g/L、(0.46±0.07)g/L，病例组C3、C4含量分别为(0.49±0.07)、(0.10±0.15)g/L，病例组C3、C4含量较对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表8。

组别C3C4对照组1.28±0.200.46±0.07病例组0.49±0.07*0.10±0.15*

注：与对照组比较,*P<0.05

表9　2组Th1/Th2细胞因子与机体免疫功能的关系

注：*P<0.05

3讨论

综上所述，布鲁氏菌病患者外周血成熟树突状细胞数量减少，同时Th1细胞功能及相关细胞因子TNF-α、IFN-γ含量降低，Th2细胞功能及相关细胞因子IL-6、IL-10含量升高，提示T淋巴细胞免疫应答在机体抗布鲁氏菌感染中发挥关键作用，而在布鲁氏菌病发生发展过程中机体存在免疫功能紊乱。在免疫调节治疗中监测患者细胞免疫应答水平对于制定治疗措施及评估患者预后具有重要指导价值。

参考文献

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3李梦东主编.实用传染病学.第1版.北京：人民卫生出版社，2000.480.

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7董炳梅，王金良，唐娜，等.布鲁氏菌的致病机制与细胞免疫机制研究进展. 中国人兽共患病学报，2012，28：635-639.

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.14.004

【中图分类号】R 576.7

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)14-2097-04

(收稿日期：2016-02-16)

The detection and significance of dendritic cells in peripheral blood and Th1/Th2 cytokine content in patients with brucellosis

GUYuru,LIUYinghan,SHIShuanzhu,etal.

TheFirstDepartmentofInfectiousDiseases,InfectiousDiseasesHospitalofZhangjiakouCity,Hebei,Zhangjiakou075000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the detection and significance of dendritic cells (DC) in peripheral blood and Th1/Th2 cytokine content in patients with brucellosis.MethodsA total of 50 patients with brucellosis who were admitted and treated in our hospital from October 2014 to October 2015 were enrolled in the study (case group). Moreover the other 50 healthy subjects were served as control group. The expression levels of T-bet, GATA-3, RORγt, Foxp3, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-10 at mRNA levels were detected by Real time-PCR. The expression levels of TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-10 at protein levels and contentsof complement C3 and C4 were measured by ELISA. The dendritic cells phenotype, Th1, Th2 and T cell subsets,the levels of T T cell and NK cell were detected by flow cytomertry.ResultsIn case group the levels of Th1cell-related transcription factors-T-bet,RORγt,Foxp3 and Th1cells,Th1/Th2,TNF-α, IFN-γ were significantly decreased,however,the levels of Th2 cells,IL-6,IL-10 were significantly increased ,as compared with those in control group (P<0.05).Moreover the levels of -positive DC proportion, T cells,NK cells and complement C3,C4 were were significantly decreased,but the levels of T cells were significantly increased ,as compared with those in control group (P<0.05).The levels of TNF-αand IFN-γwere positively correlated to those of T cells, NK cells, C3,C4 (r=2.879,3.214,3.255,2.978,respectively,P<0.05),however, which were negatively correlated to those of T cells (r=-3.146,-3.011,respectively,P<0.05). Moreover the levels of IL-6 and IL-10 were negatively correlated to those of T cells,NK cells,C3,C4 (r=-2.124,-2.343,-3.423,-2.789,-2.993,-2.566,-3.758,respectively,P<0.05), however, which were positively correlated to those of T cells (r=3.465, 3.129, respectively,P<0.05).ConclusionThe mature DC cell counts in peripheral blood of patients with brucellosis are decreased, at the same time, the Th1/Th2 cells and related cytokins are unbalanced,which may be correlated to the decrease of organism natural immunity and cellular immune function,thus,which may play an important role in the pathogenesis and development of brucellosis.

【Key words】brucellosis; dendritic cells; Th1/Th2 cytokines; natural immunity; cell immunity