有氧运动联合褪黑素对二型糖尿病大鼠骨质疏松影响的实验研究

景会锋 王小梅

延安大学体育学院，陕西 延安 716000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是常见的代谢性骨病，近年来我国OP的患病率呈现出逐年增加的趋势，以往研究表明，糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者半数以上合并OP[1]，其发病机制尚不明确。运动和褪黑素对于2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)的益处十分明显，能有效改善糖尿病人的血脂代谢紊乱，降低氧化应激损伤，有效缓解症状[2]；运动训练作为调控骨代谢的重要因素之一，其对骨产生的力学刺激可显著提高骨中细胞因子转录、蛋白表达和骨量等，从而防治骨质疏松[3]。最近研究表明，褪黑素除了参与机体生物节律、生殖、体温、免疫功能、心血管发育等方面的调节以外，还可以通过提高抗氧化、影响降钙素和甲状旁腺素的分泌，参与了钙的新陈代谢，对骨的形成、骨量的增加等方面有积极作用[4]。随着人年龄增长(尤其是女性)，血清中的褪黑素水平下降，骨质疏松症的发生几率明显增加[5]，且与此相关。对2型糖尿病与骨质疏松的相关性，国内外学者有所探讨[6,7]，但鲜有从运动疗法方面结合褪黑素对糖尿病骨质疏松症(diabetic osteoporosis，DOP) 的关系做进一步的研究。本实验用DM大鼠模型，综合评价有氧运动结合外源性褪黑素的补充对T2DM患者预防OP的作用，对改善糖尿病患者的症状，预防并发症的发生有实际意义。

1 材料和方法

1.1 材料

雌性SD大鼠80只(购于西安交通大学实验动物管理中心)，6w，体重200～220g，动物室内温度(22±2)℃，相对湿度45%～55%，每天按自然昼夜照明，光照时间12h，分笼饲养，自由饮水，国家标准啮齿类普通饲料喂养。

1.2 实验方法

1.2.1大鼠分组及DOP模型的建立：适应性喂养1 w后，随机分为8组：安静对照组(N)、正常有氧运动组(E)、正常褪黑素组(M)、正常有氧运动褪黑素组(EM)、糖尿病对照组(D)、糖尿病有氧运动组(DE)、糖尿病褪黑素组(DM)、糖尿病有氧运动褪黑素组(DEM)，每组各10只，N组大鼠不加任何干预，D、DE、DM和DEM组大鼠一次性腹腔注射35 mg/kg链脲佐菌素(STZ)，STZ购买于Sigma公司，现配现用，注射7 d后尾静脉采血测试血糖浓度，血糖浓度大于16.7 mmol/L且持续3 w，为暂时成模大鼠[8]。注射STZ后，D组大鼠在实验结束前第13天进行颈部皮下注射盐酸四环素(25 mg/kg)，作为第1次荧光标记，在实验结束前第3天进行颈部皮下注射calcein(5 mg/kg)作为第2次荧光标记，以在骨表面形成黄色和绿色双荧光标志，两次荧光标记间隔时间为10 d，可动态观察两次注射期间骨形成的情况。末次实验后分离大鼠右侧胫骨，用甲基丙烯酸甲酯包埋做不脱钙骨切片，采用半自动图像数字化分析仪并计算出新生骨小梁面积百分比，D组大鼠胫骨上段骨小梁面积百分数由25.71降低到14.78，提示D组大鼠伴随骨量丢失。

1.2.2褪黑素干预：褪黑素购买于Sigma公司，使用前溶于2%的乙醇溶液中，M组、EM组、DM组和DEM组大鼠每天灌胃40 mg/kg褪黑素，N组、E组、D 组和DE组每天灌胃等体积的2%乙醇溶液。

1.2.3运动训练方案：E、EM、DE和DEM组大鼠采用递增负荷的方式进行跑台有氧运动，起始速度为10 m/min，时间为20 min，适应性训练1 w后开始正式训练。运动负荷参考Bedford的研究加以调整，每周训练5 d，速度逐渐递增由10 m/min增至20 m/min，训练时间递增值为5 min/d[9]。整个训练过程共持续6 w，EM组和DEM组大鼠灌胃给药30 min后开始训练。

1.2.4仪器设备与观察指标的测定：于末次训练结束后，按50 mg/kg的剂量腹腔注射2%的戊巴比妥钠溶液麻醉后，仰卧位置于DXA探头之下，固定四肢，使椎体保持竖直，双侧股骨保持水平状态，应用双能X线BMD测定仪测定腰椎(L3-L6)和左右股骨BMD。BMD测试结束后，迅速分离颈总动脉，采血4 mL，注入含乙二胺四乙酸钠30 μL和10%抑肽酶40 μL的试管中，混匀，离心半径12 cm，离心(3000 r/min，10 min，4℃)，分离血浆，-20℃保存，备用待测血糖、SOD(superoxide dismutase)、MDA(malonaldehyde)、GSH-Px(glutathione peroxidase)、血Ca、P、PTH(parathyroid hormone)，血糖和血Ca、P测定应用东芝全自动生化分析仪，SOD、MDA、GSH-Px 的测试严格按照试剂盒说明，试剂盒购于南京建成生物科技有限公司，应用放射免疫法测定PTH，PTH放免试剂盒购自中国人民解放军总医院长城免疫研究所。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠体重的变化

表1 各组大鼠体重的变化Table 1 The change of body weight in rats of each group (g, n=10,

注： 和N组比较，▲P<0.05；与D组比较，★P<0.05；与DE和DM组比较，●P<0.05

Notice：Statistically significant differences when compared to N(▲P<0.05);Statistically significant differences when compared to D(★P<0.05);Statistically significant differences when compared to DME and DMM(●P<0.05)

由表1可知，与N组比较，E、M、EM组大鼠体重下降，但是无显著性差异(P>0.05)，D组大鼠体重显著性下降(P<0.05)；与D组比较，有氧运动和褪黑素干预后大鼠体重显著性升高(P<0.05)，与DME和DMM组比较，运动和褪黑素联合干预后大鼠体重进一步升高(P<0.05)。

2.2 各组大鼠椎骨和左右股骨BMD的变化

由表2可知，与N组比较，E、M、EM组大鼠椎骨和左右股骨BMD显著性升高(P<0.05)，D组大鼠椎骨和左右股骨BMD显著性下降(P<0.05)；与D组比较，有氧运动干预后大鼠椎骨和左右股骨BMD显著性升高(P<0.05)，褪黑素干预后大鼠椎骨和左右股骨BMD升高，但不具有显著性差异(P>0.05)，与DME和DMM组比较，运动和褪黑素联合干预后大鼠椎骨和左右股骨BMD显著性升高(P<0.05)。

表2 各组大鼠椎骨和左右股骨BMD的变化Table 2 The change of vertebral and femoral BMD in rats of each group (g/cm2,

注： 和N组比较，▲P<0.05；与D组比较，★P<0.05；与DE和DM组比较，●P<0.05

Notice：Statistically significant differences when compared to N(▲P<0.05);Statistically significant differences when compared to D(★P<0.05);Statistically significant differences when compared to DME and DMM(●P<0.05)

2.3 各组大鼠血糖与血清总Ca、P和PTH的变化

表3 各组大鼠血糖与血清总Ca、P和PTH的变化Table 3 Changes of blood glucose, serum total Ca, P, and PTH in rats of each group

注： 和N组比较，▲P<0.05；与D组比较，★P<0.05；与DE和DM组比较，●P<0.05

Notice：Statistically significant differences when compared to N(▲P<0.05);Statistically significant differences when compared to D(★P<0.05);Statistically significant differences when compared to DME and DMM(●P<0.05)

由表3可知，与N组比较，E、M、EM组大鼠血糖、血PTH、血Ca和血P无显著性变化(P>0.05)，D组大鼠血糖和血PTH显著性升高(P<0.05)，血Ca显著降低(P<0.05)，血P无明显变化(P>0.05)；与D组比较，有氧运动和褪黑素干预后大鼠血糖和血PTH显著性降低(P<0.05)，血Ca显著升高(P<0.05)，血P无明显变化(P>0.05)，与DE和DM组比较，运动和褪黑素联合干预后大鼠血糖和血PTH显著性降低(P<0.05)，血Ca显著升高(P<0.05)，血P无明显变化(P>0.05)。

2.4 各组大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性和MDA含量的变化

表4 各组大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性和MDA含量的变化Table 4 The changes of SOD, GSH-Px activity, and MDA content in rats of each

注： 和N组比较，▲P<0.05；与D组比较，★P<0.05；与DE和DM组比较，●P<0.05

Notice：Statistically significant differences when compared to N(▲P<0.05);Statistically significant differences when compared to D(★P<0.05);Statistically significant differences when compared to DME and DMM(●P<0.05)

由表4可知，与N组比较，E、M、EM组大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)，D组大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)；与D组比较，有氧运动和褪黑素干预后大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)，与DE和DM组比较，运动和褪黑素联合干预后SOD、GSH-Px 活性显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)。

3 讨论

以往对D2M的研究表明，病程持续时间越长，体重降低程度则越明显，Tong等[10]研究发现模拟失重可明显降低大鼠的股骨生物力学指标值，由此表明，体重下降是发生骨质疏松的危险因素之一；另有部分研究则显示BMD与体脂百分比呈正相关，单就BMD与脂肪的关系而言，目前研究尚未取得一致结果，徐君翔[11]认为脂肪含量对BMD有显著的影响，局部脂肪比例增加BMD下降显著。本研究则证实，随着D2M大鼠体重下降，体脂降低，BMD下降，有氧运动和褪黑素干预后可明显抑制大鼠体重下降，同时BMD下降的趋势也得到缓解。

运动是影响BMD的一个重要因素。运动方式不同对骨骼的负荷作用不同，对BMD产生的不同影响。适度的运动在增加肌肉重量、增强肌力的同时，BMD也可获得不同程度的提高，有研究显示，肌力与BMD呈正相关，肌力的增加有助于骨量的维持[12,13]。大量研究证明，体育锻炼可增加峰值的骨量，而峰值骨量是决定是否出现骨质疏松症状的关键性因素。研究发现中等强度跑台运动通过抑制骨吸收对去卵巢大鼠股骨下端松质骨的骨量和骨结构产生了良好的影响[14]。另有研究表明高强度运动，更有利于骨的矿化[15]；同时随着运动强度的增加，BMD值逐步增加。本研究也证实运动能改善BMD，运动时骨骼受到挤压力和剪切力的直接刺激作用外，还有来自肌肉收缩对骨骼的牵拉刺激，有助于骨形成和重建，从而增加BMD；另外，运动还能增加胃肠道对营养物质和钙的吸收，体内维生素D浓度增高等作用来提高BMD。综上所述，运动对大鼠骨产生的直接力学刺激有可能通过提高骨形成并抑制骨吸收，从而使得大鼠BMD显著增加。

血清Ca、P测定是可间接反应骨代谢情况[16]。已有研究表明，糖尿病大鼠长期的高血糖会引起Ca、P摄入减少而丢失增加，血Ca降低，PTH分泌增加，动员大量骨Ca入血，致使骨质疏松[17]，也有临床证据表明长期高血糖环境不利于骨胶原交联[18]。另外，Balint等指出高血糖毒性作用可以成骨细胞抑制对Ca的摄取，可能与糖尿病发生时骨结构改变有关。在 T1DM患者中BMD值是降低的，对T2DM患者的大量研究表明，BMD值可以正常，降低或升高。本研究则证实，D2M大鼠血糖和PTH水平显著升高的同时，伴随血Ca显著降低，椎骨和左右股骨BMD均显著性下降，这或许是由于D2M大鼠长期的高血糖能够降低血Ca水平，而低血Ca进而影响骨矿化，使得血PTH反馈升高，并且与血糖升高水平成正相关，从而降低BMD。因此，可以认为糖尿病通过高血糖引起的低血Ca、高PTH降低BMD，形成骨质疏松。

褪黑素主要由松果体合成与分泌，近年来众多实验证明，褪黑素对于骨的重建过程具有重要作用，一方面能促进骨的发生，另一方面能防止骨的退化。外源性褪黑素促进了多种前成骨细胞系以及人骨髓间充质干细胞的进一步分化，在骨的发生中有至关重要的调节作用，能促进成骨过程。褪黑素在钙新陈代谢方面的作用最初由Csaba等研究发现，这个作用由褪黑素通过影响降钙素与PTH的分泌介导的。本研究也证实褪黑素干预后，血糖和血清PTH降低，血钙升高，同时伴随BMD的增加。

大量研究表明，当DM患者血糖水平升高时，会使氧化应激水平增高，从而促进DOP的发生与发展，这点提示控制血糖可能是防治DOP的一个非常重要途径[19]。氧化应激主要通过耗竭抗氧化物质、激活破骨细胞、抑制成骨细胞及骨形成来影响骨代谢。血清中的SOD、GSH-Px活性和MDA含量一直被认为是反映氧化应激的敏感指标[20]，本研究表明，T2DM大鼠血清中的SOD、GSH-Px活性降低和MDA含量升高，抗氧化应激能力减弱，骨代谢过程紊乱。以往研究表明，运动特别是有氧运动可以提高机体的抗氧化应激的能力[21]，褪黑素是一种非酶类抗氧化物质，具有较强的抗氧化应激作用[22]，本研究结果显示，经过6w的有氧运动和褪黑素治疗后，血清中SOD和GSH-Px活性明显升高，MDA含量明显下降，从而减少氧化应激损伤。规律运动能够稳定控制血糖水平已被诸多研究所证实。但是不同方式运动对血糖影响的报道不多，且尚有争议。大量资料表明, 对于改善糖和胰岛素抵抗代谢, 有氧运动能够加快骨骼肌对糖的摄取，从而有效降低血糖。本研究表明，有氧运动和褪黑素干预后大鼠血糖显著性降低，血Ca显著性升高，同时血PTH水平降低，且联合干预后大鼠后效果更好。近年研究[23]证实，高糖抑制成骨细胞的增殖、分化，导致成骨细胞功能下降，Orifuji等发现3w的有氧运动可降低Ⅱ型糖尿病大鼠血糖的水平，与本研究的结果相一致。

综上所述，糖尿病持续高血糖使血Ca下降，PTH反馈性升高和清除自由基能力减弱，引起BMD下降，导致骨质疏松的发生；有氧运动联合褪黑素共同干预可以明显改善糖代谢的同时还可以提高抗氧化应激能力，降低高糖氧化应激对骨骼代谢的影响，有效控制体重和BMD下降，缓解骨质疏松，可以为临床上糖尿病引发的骨质疏松症的非药物治疗新方法提供实验依据。