1-甲基-2-喹诺酮类衍生物的合成及其抗肿瘤活性

陈春雪, 尤朋涛, 刘焱文, 陈　新

(湖北中医药大学 中药资源与中药化学湖北省重点实验室，湖北 武汉　430065)



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1-甲基-2-喹诺酮类衍生物的合成及其抗肿瘤活性

陈春雪, 尤朋涛, 刘焱文, 陈新*

(湖北中医药大学 中药资源与中药化学湖北省重点实验室，湖北 武汉430065)

摘要：以喹啉类化合物为原料，经甲基化反应和氧化反应制得中间产物2-喹诺酮类化合物(2a～2c)； 2a～2c经硝化反应制得7个硝化-2-喹诺酮类化合物(3a～3g)； 3a, 3e～3g经移位取代反应合成了4个1-甲基化-4-氰化-2-喹诺酮类衍生物(4a, 4e～4g)，其结构经1H NMR，13C NMR和HR-MS(EI)确证。采用MTT法评价了化合物对MCF-7, H1299, A549, PC-12, CT-26及HepG-2肿瘤细胞的抗增殖作用。研究结果表明：部分化合物对肿瘤细胞的抑制活性明显高于喹啉系列物，其中1,8-二甲基-3,5,7-三硝基-2-喹诺酮(3e)显著抑制六种肿瘤细胞的增殖，对A549的抑制活性最高，IC50为2.05 μmol·L-1； 1-甲基-6,8-二硝基-4-氰基-2-喹诺酮(4a)可选择性抑制A549和CT-26肿瘤细胞，IC50分别为9.34 μmol·L-1和18.43 μmol·L-1。

关键词：喹啉; 2-喹诺酮衍生物; 移位取代反应; 合成; 抗肿瘤活性

喹诺酮类，又称吡啶酮酸类，最早是通过化学合成法得到具有抗菌活性的药物，根据酮基的位置，可分为2-喹诺酮类和4-喹诺酮类两大类[1]。天然2-喹诺酮类化合物主要存在于芸香科植物中，并具有一定的生理活性，如从吴茱萸干燥近成熟果实中分离得到3-二甲基-4-甲氧基-2-喹诺酮，进一步的药理研究表明该生物碱成分具有免疫抑制、抗肿瘤、松弛血管平滑肌、选择性的抑制幽门螺杆菌及抗蠕虫等作用；从黄皮属植物中分离得到的2-喹诺酮类化合物对A549, BGC-823和HeLa细胞具有明显的细胞毒活性；从蚬壳花椒中首次分离出生物碱4-甲氧基-2-喹诺酮,研究发现其具有与抗老年痴呆活性相关的内酯胺结构；从野花椒中发现的2-喹诺酮类单体化合物加锡果宁对缺氧，缺血动物具有保护作用，野花椒碱可以抑制由凝血酶诱导的血小板凝集，4-甲氧基-1-甲基-2-喹诺酮可以选择性的抑制由花生四烯酸诱导的血小板凝集；从单面针中发现了4-甲氧基-1-甲基-2-喹诺酮具有抗氧活性[2-9]。

Scheme 1

近年来，随着喹诺酮类化合物抗肿瘤作用机制与抗菌作用机制相似的研究发现，两者均为通过拓扑异构酶Ⅱ调节DNA分子内或分子间链接的多基因酶系而快速抑制肿瘤。2-喹诺酮类作为一类新型的抗癌药物，已经成为抗肿瘤药物研发的方向之一。已报道的人工合成的2-喹诺酮类化合物，往往具有广泛的药理活性作用，如细胞毒活性[10]、SRSA拮抗剂[11]、烟碱受体激动剂[12]、抗贫血活性[13]、抗亲缘活性[14]、抗微生物活性[15]、抗菌活性[16]、糜酶抑制作用[17]和二肽基肽酶IV抑制作用[18]等。喹诺酮骨架是药物分子和生物活性物质中广泛存在的优势结构。

基于此，本文设计并合成2-喹诺酮类衍生物，并研究其构效关系，以期找到新型抗肿瘤2-喹诺酮类药物。以喹啉类化合物(1a～1c)为起始原料，经甲基化反应和氧化反应制得中间产物2-喹诺酮类化合物(2a～2c)； 2a～2c经硝化反应制得7个硝化-2-喹诺酮类化合物(3a～3g)； 3a, 3e～3g经移位取代反应合成了4个1-甲基化-4-氰化-2-喹诺酮类衍生物(4a, 4e～4g， Scheme 1)，其结构经1H NMR，13C NMR和HR-MS(EI)确证。并采用MTT法评价了目标化合物对MCF-7, H1299, A549, PC-12, CT-26及HepG-2肿瘤细胞的抗增殖作用。

1实验部分

1.1仪器与试剂

Yanaco型数字显微熔点仪；Bruker Ascend-400型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；JASCO FT/IR-4200型红外光谱仪；JEOL JMS-DX303HF型质谱仪；Sheldon CO2型恒温培养箱；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台；CK2型倒置显微镜；BIO-RAD型酶标仪。

人乳腺癌细胞MCF-7，人肺癌细胞H1299和A549，大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC-12细胞，小鼠的大肠癌细胞CT-26，人肝癌细胞HepG-2， ATCC细胞库；四甲基偶氮唑蓝MTT(武汉飞羿科技有限公司)；Gibco FBS； RPIM-1640培养基，HyClone公司；胰蛋白酶，HyClone公司；PBS磷酸盐缓冲液；其余试剂均为分析纯或化学纯。

1.2合成[19]

(1) 2a～2c的合成(以2a为例)

在反应瓶中加入喹啉(1a)5.41 mL(45.8 mmol)，搅拌下缓慢滴加硫酸二甲酯4.34 mL(45.8 mmol)，滴毕(约10 min)，于60 ℃反应30 min。加入15 mL水淬灭反应，冰浴冷却下同时滴加K3[Fe(CN)6] 32.28 g(98 mmol)的水(128 mL)溶液和NaOH 8.04 g(201 mmol)的水(26 mL)溶液，滴毕(约1 h)，于室温反应过夜。抽滤，滤液用氯仿(4×50 mL)萃取，合并萃取液，用无水MgSO4干燥，旋蒸浓缩后用正己烷(8×30 mL)加热回流萃取，合并萃取液，减压浓缩得2a 5.83 g。

用类似方法合成2b～2c。

2a: 黄色固体，收率80%;1H NMRδ: 3.73(s, 3H), 6.71(d,J=9.5 Hz, 1H), 7.23(dd,J=7.1 Hz, 7.2 Hz, 1H), 7.37(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.56(d,J=7.1 Hz, 1H), 7.58(dd,J=7.2 Hz, 8.9 Hz, 1H), 7.67(d,J=9.5 Hz, 1H);13C NMRδ: 30.4, 115.6, 120.4, 121.8, 124.2, 128.1, 128.8, 137.8, 139.5, 162.5。

2b： 亮黄色固体，收率84%;1H NMRδ: 2.38(s, 3H), 3.60(s, 3H), 6.59(d,J=9.6 Hz, 1H), 7.43(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.46(dd,J=8.4 Hz, 1.6 Hz, 1H), 7.51(brs, 1H), 7.83(d,J=9.6 Hz, 1H);13C NMRδ: 20.0, 28.9, 114.5, 120.0, 121.0, 128.3, 130.9, 131.8, 137.8, 138.9, 161.0。

2c： 黄色固体，收率85%;1H NMRδ: 2.71(s, 3H), 3.74(s, 3H), 6.57(d,J=9.2 Hz, 1H), 7.15(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.40(dd,J=7.6 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.52(dd,J=7.6 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.83(d,J=9.2 Hz, 1H);13C NMRδ: 23.4, 35.6, 120.4, 121.8, 122.3, 125.0, 127.3, 135.1, 140.0, 140.7, 163.1。

(2) 3a～3g的合成(以3a为例)

在反应瓶中加入发烟硝酸12 mL(290 mmol)，冰浴冷却，搅拌下缓慢加入2a 1.7 g(10.5 mmol)，加毕，回流(120 ℃)反应7 h。冷却至室温，加水100 mL，抽滤，滤饼用乙腈重结晶得黄色针状晶体3a 2.00 g。

用类似方法合成3b～3g。

3a： 黄色固体，收率65%;1H NMRδ: 3.43(s, 3H), 9.08(d,J=2.8 Hz, 1H), 9.25(d,J=2.8 Hz, 1H), 9.28(s, 1H);13C NMRδ: 35.2, 120.2, 124.8, 130.5, 136.3, 137.6, 138.5, 140.9(2C), 154.4。

3b： 黄色固体，收率16%, m.p.189～191 ℃;1H NMRδ: 2.42(s, 3H), 3.40(s, 3H), 8.55(s, 1H), 8.69(s, 1H);13C NMRδ: 16.0, 35.3, 112.3, 125.2, 128.1, 132.8, 132.8, 139.6, 142.5, 149.9, 153.8; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C11H8N4O7[M+]308.039 3, found 308.039 3。

3c： 黄色固体，收率21%, m.p.112～115 ℃;1H NMRδ: 2.37(s, 3H), 3.33(s, 3H), 6.92(d,J=10.0 Hz, 1H), 7.74(d,J=10.0 Hz, 1H), 8.32(s, 1H);13CNMRδ: 15.6, 34.0, 114.6, 123.2, 125.3, 129.7, 131.8, 132.3, 139.3, 149.2, 160.8; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C11H9N3O5[M+]263.054 2, found 263.054 2。

3d： 黄色针状固体，收率45%, m.p.259～261 ℃;1H NMR(CD3CN)δ: 2.44(s, 3H), 3.77(s, 3H), 7.72(d,J=9.2 Hz, 1H), 7.81(d,J=9.2 Hz, 1H), 8.31(s, 1H);13C NMRδ: 16.4, 30.9, 108.7, 118.7, 124.8, 128.3, 136.5, 139.2, 142.1, 148.2, 152.9; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C11H9N3O5[M+] 263.054 2, found 263.053 7。

3e： 黄色固体，收率27%, m.p.188～190 ℃;1H NMRδ: 2.85(s, 3H), 3.82(s, 3H), 8.53(s, 1H), 8.60(s, 1H);13C NMRδ: 23.2, 37.7, 111.0, 127.9, 131.3, 131.6, 133.2, 140.7, 142.8, 145.9, 154.9; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C11H8N4O7[M+]308.039 3, found 308.039 5。

3f： 黄色固体，收率40%, m.p.216～219 ℃;1H NMRδ: 2.84(s, 3H), 3.78(s, 3H), 6.92(d,J=9.6 Hz, 1H), 7.66(d,J=9.6 Hz, 1H), 8.39(s, 1H);13C NMRδ: 23.4, 36.4, 113.2, 125.6, 129.5, 129.9, 131.8, 131.8, 140.0, 146.0, 162.1; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C11H9N3O5[M+]263.054 2, found 263.054 1。

3g： 黄色固体，收率28%, m.p.236～238 ℃;1H NMRδ: 2.84(s, 3H), 3.85(s, 3H), 8.42(d,J=2.8 Hz, 1H), 8.80(d,J=2.8 Hz, 1H), 9.09(s, 1H);13C NMRδ: 23.2, 37.0, 118.4, 125.2, 128.4, 131.1, 136.7, 140.3, 142.0, 146.0, 155.4; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C11H9N3O5[M+]263.054 2, found 263.054 1。

(3) 4a, 4e～4g的合成(以4a为例)

在反应瓶中加入3a 147 mg(0.5 mmol)和乙腈20 mL，搅拌下缓慢加入氰化钾33 mg(0.5 mmol),加毕，于60 ℃反应2 h；冷却至室温，减压浓缩后经硅胶柱层析[洗脱剂：V(正己烷) ∶V(乙酸乙酯)=7 ∶3]纯化得4a 87 mg。

用类似方法合成4e～4g。

4a： 黄色粉末，收率63%; m.p.168～171 ℃;1H NMRδ: 3.37(s, 3H), 7.89(s, 1H), 8.70(d,J=2.6 Hz, 1H), 9.07(d,J=2.6 Hz, 1H);13C NMRδ: 34.8, 113.6, 119.4, 121.7, 123.6, 124.7, 132.3, 137.2, 138.7, 140.5, 160.1; IRν: 2 247 cm-1; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C11H6N4O5[M+]274.033 8, found 274.033 7。

4e： 红色固体，收率83%; m.p.221～223 ℃;1H NMRδ: 2.78(s, 3H), 3.69(s, 3H), 7.86(s, 1H), 8.50(s, 1H);13C NMRδ: 23.2, 38.1, 108.3, 112.0, 115.6, 130.7, 131.0, 133.6, 136.4, 138.3, 146.8, 160.1; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C12H8N4O5[M+]288.049 5, found 288.049 4。

4f： 黄色固体，收率47%, m.p. 215～217 ℃;1H NMRδ: 2.86(s, 3H), 3.77(s, 3H), 7.02(d,J=9.6 Hz, 1H), 8.17(d,J=9.6 Hz, 1H), 8.42(s, 1H);13C NMRδ: 23.7, 36.4, 113.4, 119.2, 123.0, 125.4, 129.2, 129.7, 132.3, 135.6, 145.1, 162.3; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C12H9N3O3[M+]243.064 4, found 243.063 9。

4g： 棕色固体，收率90%， m.p.197～198 ℃;1H NMRδ: 2.84(s, 3H), 3.79(s, 3H), 7.66(s, 1H), 8.39(d,J=2.4 Hz, 1H), 8.41(d,J=2.4 Hz, 1H);13C NMRδ: 23.3, 36.8, 114.3, 117.8, 119.4, 122.0, 128.8, 129.8, 130.7, 141.6, 145.2, 161.2; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C12H9N3O3[M+]243.064 4, found 243.063 7。

1.3抗肿瘤活性测定

取对数生长期的细胞株,加入胰酶，消化后，用含10%小牛血清的RMPI-1640培养基配制为单个细胞悬液(5×104个·mL-1)并接种于96孔培养板(每孔100 μL)[20]。置于37 ℃, 5%CO2培养箱中培养12 h。实验组分别加入用DMSO溶解，培养液稀释的不同浓度(20.00， 10.00， 5.00， 2.50， 1.25 μg·mL-1)的各化合物溶液。每组都各设3个平行孔，同时设对照组和空白组。相同条件下培养24 h。每孔中加入10 μL MTT(5 mg·mL-1磷酸缓冲盐溶液)，继续温育4 h，吸去各孔内上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪在490 nm处测定各孔OD值[21]。实验重复3次，计算一定浓度下化合物对细胞的抑制率，并按下式计算各化合物的IC50值。

2结果与讨论

2.1合成

以喹啉系列物为反应起始物，经甲基化、氧化、硝化和cine-substitution反应合成了一系列1-官能化-4-氰化-2-喹诺酮类衍生物。实验结果表明：当1-位和8-位存在双取代时，2-喹诺酮吡啶环的4-位上可引入多种亲核基团，从而制得一系列4-位官能化的2-喹诺酮类衍生物，为筛选具有生理活性的化学药物提供来源。

2.2抗肿瘤活性

化合物对六种肿瘤细胞体外抑制活性的结果见表1。由表1可见：2c， 3d， 4g对六种肿瘤细胞的增值并没有抑制作用；硝化产物3a～3c， 3e～3g对受试细胞则表现出了较好的抑制作用。而且三硝基取代的3a， 3b， 3e总体比二硝基取代的3c， 3f， 3g的抗肿瘤活性较好。其中1,8-二甲基-3,5,7-三硝基-2-喹诺酮(3e)对A549的抑制活性最高，IC50为2.05μmol·L-1。 4-位氰基化产物1-甲基-6,8-二硝基-4-氰基-2-喹诺酮(4a)选择性的抑制A549和CT-26肿瘤细胞，IC50分别为9.34μmol·L-1和18.43μmol·L-1。

表1　化合物的抗肿瘤活性

以喹啉类化合物为原料，合成了系列1-官能化-4-氰化-2-喹诺酮类衍生物。

初步的体外抗肿瘤活性实验结果表明：1-甲基-6,8-二硝基-4-氰基-2-喹诺酮(4a)对不同来源肿瘤细胞的敏感性存在差异，对A549和CT-26肿瘤细胞具有相对较高的选择性。硝基产物的抗肿瘤活性较好，且化合物的硝基取代越多其抗肿瘤活性越好,说明硝基可能是其抗肿瘤活性的关键基团。1,8-二甲基-3,5,7-三硝基-2-喹诺酮(3e)对A549的抑制作用较好，其IC50(2.05μmol·L-1)较小，预示着该化合物具有潜在的抗肿瘤应用价值。有关其毒性及抗肿瘤作用的机制等有待进一步研究和探讨。

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收稿日期：2016-05-03

基金项目：湖北中医药大学科研启动基金项目(000913)； 青苗计划(5112-0007)

作者简介：陈春雪(1992-)，女，汉族，湖北随州人，硕士研究生，主要从事天然活性产物的化学合成与结构修饰研究。 E-mail: 1575964321@qq.com 通信联系人： 陈新，助理研究员， E-mail: chenxin30172@hotmail.com

中图分类号：O625.42

文献标志码：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.07.16118

Synthesis and Antitumor Activities of 1-Methy-2-quinolone Derivatives

CHEN Chun-xue,YOU Peng-tao,LIU Yan-wen,CHEN Xin*

(Resource and Chemistry of Chinese Medicine Hubei Provincial Key Laboratory,Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China)

Abstract：Three 2-quinolones(2a～2c) were synthesized by methylation and oxidation under basic condition from quinolines. Seven nitro-2-quinolones(3a～3g) were obtained by nitration of 2a～2c. Finally, four 1-methyl-4-cyanide-2-quinolones(4a, 4e～4g) were synthesized by cine-substitution reaction of 3a, 3e～3g with potassuim cyanide. The structures were confirmed by1H NMR,13C NMR and HR-MS(EI). The antitumor activities of the compounds were investigated by MTT assay against MCF-7, H1299, A549, PC-12, CT-26 and HepG-2. The results showed that some of compounds exhibited better inhibition activities than quinolines. 1,8-Dimethyl-3,5,7-trinitroquinolin-2(1H)-one(3e) exhibited good inhibition activities against the six cancer cell lines, especially A549 cell with IC50of 2.05 μmol·L-1. 1-Methyl-6,8-dinitro-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-4-carbonitrile(4a) showed better inhibition activities against A549 and CT-26 with IC50of 9.34 μmol·L-1and 18.43 μmol·L-1, respectively.

Keywords：quinoline; 2-quinolone derivative; cine-substition; synthesis; antitumor activity