Wnt信号通路在结肠癌中的表达及其作用机制

邹慧娟　郑　航　李明君　姜媛媛　张　利　张　洋　肖兴国

(新乡市中心医院感染性疾病科，河南　新乡　453000)



Wnt信号通路在结肠癌中的表达及其作用机制

邹慧娟郑航1李明君2姜媛媛3张利3张洋3肖兴国3

(新乡市中心医院感染性疾病科，河南新乡453000)

目的探讨Wnt信号通路在结肠癌中的表达及其相关的分子机制。方法用酶联免疫吸附法(ELISA)检测所有参与者(65例结肠癌和30例健康人)血清中半乳糖凝集素(galectin)-3的含量，观察galectin-3和人结肠癌发病的关系，荧光实时定量PCR检测人结肠癌组织和癌旁组织中相关基因的表达。Western印迹检测人结肠癌组织和癌旁组织中相关蛋白的表达水平，包括轴蛋白基因(AXIN)、β-catenin，c-myc和cyclin D1蛋白。结果血清中的galectin-3水平在结肠癌Ⅲ期患者血清中的含量较健康对照组明显升高(P<0.01)。结肠癌组织中AXIN mRNA表达水平下降，β-catenin mRNA表达水平不变但其下游分子c-myc和cyclin D1基因的表达水平升高。β-catenin、c-myc和cyclin D1蛋白水平均升高，Wnt信号通路明显激活。结论在结肠癌患者血清中galectin-3水平明显升高，AXIN表达水平降低，其可以活化Wnt信号通路，激活后的Wnt信号通路通过β-catenin上调细胞增殖相关因子c-myc和cyclinD1水平的升高，促进结肠癌细胞的增殖。

结肠癌；Wnt信号通路；c-myc；cyclinD1

Dsh蛋白可导致β-catenin在细胞内聚积并转至细胞核内结合并激活转录因子(Tcf/LEF)家族，上调c-myc和cyclin D1基因的表达，促进细胞的增殖和分化〔1～3〕。血清半乳糖凝集素-3(galectin-3)通过结合细胞外基质以及细胞表面的多聚体复合物，经过细胞的信号转导，最终达到抑制细胞增殖的作用〔4，5〕。研究发现在已经发生癌转移的结直肠癌患者体内galectin-3的水平明显升高〔6〕。轴蛋白基因(AXIN)是Wnt信号通路的重要负性调控因子，其通过参与组装β-catenin干扰复合物抑制Wnt信号通路的进行，进而下调Wnt和β-catenin靶基因的表达。在许多癌症组织基因的表达谱中发现，肿瘤细胞核内AXIN基因多发生缺失突变，核内β-catenin的水平升高〔7〕。但是Wnt信号通路在结肠癌中的表达及其作用机制目前尚不清楚，本文就此探究 Wnt信号通路与结肠癌的机制。

1　材料与方法

1.1病例选取2013年8月至2015年8月在我院住院的结肠癌病人65例，其中男35例，女30例，年龄32～67〔平均(43.22±10.55)〕岁。均经过活检和病理诊断分级，其中肿瘤的分期和分级参照美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟(AJCC/UICC)颁布的结直肠癌的肿瘤分期和分级标准，所有入组者的肿瘤组织均为术后标本，具体病理分期为Ⅲ期。所有患者均为首发结肠癌，病情稳定，未接受过放射治疗和化学治疗，无合并肿瘤出血、肠穿孔、肠梗阻、急慢性感染。手术病人肿瘤组织的癌旁组织作为对照组。另外选取30名健康志愿者作为健康对照组，于早晨空腹时抽血。向所有入组者说明取组织的目的和研究的性质，并签署知情同意书，该研究方案已经通过医院伦理委员会审批。所有参与者于早晨空腹时候抽血约4 ml，分离血清，血清和组织均于-80℃冰箱保存，用于后续检测。

1.2材料和试剂人galectin-3酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；RIPA裂解液(碧云天)，蛋白酶抑制剂(PMSF，碧云天)，组织样品研磨机(上海净信科技)；AXIN抗体、beta-catenin抗体、actin抗体均购自上海银海圣生物科技有限公司。SYBR green(罗氏)，荧光实时定量PCR仪(Applied Bio-systems公司)；Trizol(Invitrogen公司)，反转录试剂盒(Invitrogen公司)。

1.3ELISA 检测血清中galectin-3含量所有参与者血清中galectin-3的含量均采用ELISA法检测，检测原理双抗体夹心法，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，通过标准曲线计算人血清中galectin-3的含量。

1.4荧光实时定量PCR检测相关基因的表达选取3名具有代表性的结肠癌患者的癌组织，并以癌旁相对正常的组织作为对照，分别称取10 g癌组织和癌旁组织，加入Trizol裂解液后用组织研磨机磨碎，按照Invitrogen公司的操作方法提取组织中的RNA并反转为cDNA，利用荧光实时定量PCR仪检测相关基因的表达。引物序列：Axin正向:CGCAGGTTCTTGGTCACTGT，反向：TGTTCACGAAAGCCAGAGCG；β-catenin正向：GCTCAACTACGGTGCAGATTC，反向：GCACGATGTCTTGATGTCCC；c-myc正向：ACATCAAGACATCGTGCGATATT，反向：CCAGCGGTACACAAAGACCA；cyclin D1正向：AACTCTTTCGGTCGTACCCCC，反向：GCGTGCTTGAGCTGAAGCTA；actin正向：AGGGGAGAGCGGGTAAGAGA，反向：AGTAGGAGAGAGCGAGCGACC。

1.5Western印迹检测癌组织相关蛋白的表达水平选取和荧光实时定量PCR检测同样的3名结肠癌患者的癌组织，并以癌旁相对正常的组织作为对照，分别称取30 g癌组织和癌旁组织，加入RIPA蛋白裂解液后用组织研磨机磨碎，按照Western印迹操作方法包括蛋白抽提，电泳跑胶，转膜，抗体孵育，显影和凝胶图像分析等步骤，检测相关蛋白的表达水平。

2　结　果

2.1健康对照组和结肠癌Ⅲ期患者血清中galectin-3水平比较健康对照组galectin-3的含量〔(1.05±1.24)ng/L〕远远低于结肠癌Ⅲ期患者〔(5.75±1.89)ng/L,P<0.05〕。

2.2实时定量PCR检测结肠癌组织中相关基因的表达在结肠癌组织中AXIN mRNA的表达水平(0.37±0.16)明显降低(在正常组织中表达设为1，P<0.05)。同时发现虽然β-catenin mRNA水平在结肠癌(0.83±0.15)和结肠癌旁组织(设为1)中没有差异，但是β-catenin下游分子c-myc和cyclin D1基因mRNA水平在结肠癌中的表达水平(3.92±0.52、5.19±1.24)较癌旁组织(设为1)高(P<0.01)。

2.3Western印迹检测结肠癌组织中Wnt信号通路激活情况结肠癌组织中β-catenin蛋白的表达条带灰度较癌旁组织组织(设为1)明显升高。结肠癌组织中AXIN蛋白的表达量(3.83±0.87)较癌旁组织明显降低(P<0.01)；β-catenin蛋白的表达量(3.83±0.87)较癌旁组织(设为1)明显升高约3.83倍(P<0.01)。见图1。

图1　结肠癌组织中AXIN、β-catenin蛋白的表达水平

2.4Western印迹检测结肠癌组织增殖的分子机制结肠癌组织中c-myc蛋白和cyclin D1蛋白的表达条带辉度较癌旁组织组织明显升高，这表明Wnt信号通路可能通过c-myc蛋白和cyclin D1蛋白介导对结肠癌细胞增殖的促进作用。结肠癌组织中cyclin D1、c-myc蛋白的表达量(5.06±0.84，4.81±1.05)较癌旁组织(设为1)明显升高(P<0.01)。见图2。

图2　结肠癌组织中c-myc、cyclinD1蛋白的表达水平

3　讨　论

Wnt/β-catenin信号通路由许多分泌糖蛋白构成，对于调节细胞的归宿如增殖、分化、极化以及迁移具有重要作用〔8〕。干扰Wnt配体的表达或者改变Wnt/β-catenin信号通路下游分子的表达水平均可以导致小鼠胚胎发育的异常〔9〕。此外成年人中Wnt/β-catenin信号通路信号通路的异常通常伴随着癌症发生，如乳腺癌，胃癌以及肝癌中〔10〕。目前对结肠癌的发病机制的研究发现，在结肠癌中通常伴有Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，但是对于β-catenin在结肠癌中的具体的作用目前尚不清楚。本实验发现，结肠癌中Wnt/β-catenin信号通路激活后β-catenin 的转录水平不变，但是其泛素化降解减少，同时其抑制因子AXIN表达降低，共同促进β-catenin 蛋白水平增加，β-catenin 之后转移至细胞核内结合TCF/LEF转录因子，调节c-myc和cyclinD1基因的表达促进细胞增殖。此外，研究还发现galectin-3作为一个多功能分泌蛋白，升高的galectin-3促进β-catenin核内转运，正向调控细胞内的Wnt信号通路，促进结肠癌细胞的增殖，抑制结肠癌细胞的凋亡。

Wnt/β-catenin信号通路作为结肠癌增殖、侵袭的关键通路，在药物研发中可将Wnt/β-catenin信号通路中的关键分子作为靶位点，对强化结肠癌的靶向治疗具有重大意义。

1Chen KH，Lin YL，Liau JY，etal.BRAF mutation may have different prognostic implications in early-and late-stage colorectal cancer〔J〕.Med Oncol，2016；33(5)：39.

2Xing Y，Clements WK，Kimelman D，etal.Crystal structure of a beta-catenin/axin complex suggests a mechanism for the beta-catenin destruction complex〔J〕.Genes Dev，2003；17(22)：2753-64.

3Wang X，Jung YS，Jun S，etal.PAF-Wnt signaling-induced cell plasticity is required for maintenance of breast cancer cell stemness〔J〕.Nat Commun，2016；7(2)：10633.

4Arsenijevic A，Milovanovic M，Milovanovic J，etal.Deletion of galectin-3 enhances xenobiotic induced murine primary biliary cholangitis by facilitating apoptosis of BECs and release of autoantigens〔J〕.Sci Rep，2016；6(3)：23348.

5Prins CA，Almeida FM，Martinez AM.Absence of galectin-3 attenuates neuroinflammation improving functional recovery after spinal cord injury〔J〕.Neural Regen Res，2016；11(1)：92-3.

6Tripathi M，Dixit A，Chandra PS.Galectin-3，an important yet unexplored molecule in drug resistant epilepsy〔J〕.Neurol India，2016；64(2)：237-8.

7Kim HS，Kim J，Nam KH，etal.Clinical significance of midkine expression in sporadic desmoid tumors〔J〕.Oncol Lett，2016；11(3)：1677-84.

8Alghamdi S，Khan I，Beeravolu N，etal.BET protein inhibitor JQ1 inhibits growth and modulates WNT signaling in mesenchymal stem cells〔J〕.Stem Cell Res Ther，2016；7(1)：22.

9Li T，Lai Q，Wang S，etal.MicroRNA-224 sustains Wnt/beta-catenin signaling and promotes aggressive phenotype of colorectal cancer〔J〕.J Exp Clin Cancer Res，2016；35(1)：21.

10Vilchez V，Turcios L，Marti F，etal.Targeting Wnt/beta-catenin pathway in hepatocellular carcinoma treatment〔J〕.World J Gastroenterol，2016；22(2)：823-32.

〔2016-01-25修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.010

河南省科技攻关计划项目(No.132102310156)；郑州市科研项目(No.121PPTGG504-7)

邹慧娟(1968-)，女，主治医师，主要从事感染危重疾病研究。

R735.3+5

A

1005-9202(2016)14-3373-02；

1新乡市第三附属医院泌尿外科2郑州大学第一附属医院肿瘤科3郑州大学附属郑州中心医院消化内科