抗-HCV ELISA单阳、双阳献血者补充实验及跟踪分析研究

张艳梅，王新梅，郭喜彪，贠世文，姜燕娟，孟毓，王富强新乡市中心血站，河南新乡453000

抗-HCV ELISA单阳、双阳献血者补充实验及跟踪分析研究

张艳梅，王新梅，郭喜彪，贠世文，姜燕娟，孟毓，王富强
新乡市中心血站，河南新乡453000

目的对抗-HCV ELISA有反应性献血者进行追踪检测，了解其真实的病毒感染情况。方法对抗-HCV ELISA有反应性献血者在献血3个月、6个月时采集标本，进行ELISA试验、HCV PCR检测及RIBA确证3种平衡检测。结果36例单试剂阳性标本中，1例跟踪核酸检测阳性，RIBA确证阳性。36例双试剂阳性标本中有20例确证阳性（55.6%），不确定11例（30.6%），阴性5例（13.9%），跟踪结果无变化。结论应尽快出台并实施献血者补充实验的具体规定，确保血液安全，减少献血者流失；在试剂的选择上应选择特异性和灵敏度都高的试剂，无论选择哪种检测方式，建议ELISA方法应选择双抗原夹心法，也希望尽快在献血者中开展NAT和ELISA平行检测，以有效降低输血传播感染病毒的风险。

抗-HCV ELISA有反应性；HCV-RNA检测；RIBA检测；补充实验；跟踪检测

［Abstract］Objective To know their true virus infection by tracking and detecting the blood donors reactive to anti-HCV and ELISA.M ethods The specimens of blood donors reactive to anti-HCV and ELISA were collected at 3-month and 6-month after donating blood，and were given three balanced detections including ELISA test，HCV PCR test and RIBA confirmation.Results In 36 cases of sero-concordant specimens，1 positive case was detected by tracking nucleic acids，and 1 positive case was confirmed by RIBA.In 36 cases of sero-discordant specimens，20 positive caseswere confirmed（55.6%），11 caseswere uncertain（30.6%），5 caseswere negative（13.9%），and the tracking results had no change.Conclusion We should make and implement specific regulations of complementary experiment of blood donors as soon as possible to ensure the blood safety and reduce the loss of blood donors，and choose the reagentwith higher specificity and sensitivity degree，the double antigen sandwich method in ELISA method is suggested to be selected whichever detection method we choose and we hope to carry out NAT and ELISA parallel detection for donors as soon as possible thus effectively reducing risks of transfusion-transmitted infection virus.

［Key words］Reactive to anti-HCV and ELISA；HCV-RNA detection；RIBA detection；Complementary experiment；Trace detection

据世界卫生组织统计，全球每年有三四百万人感染丙肝病毒，有1.3亿～1.7亿人患丙型肝炎。在我国，丙肝患者约有4000万人，丙肝发病率在所有病毒性肝炎中仅次于乙肝［1］。为控制HCV经血液传播，我国规定采用两家ELISA抗体诊断试剂筛选献血者丙型肝炎抗体或采用1种ELISA试剂检测HCV抗体，采用1种试剂检测HCV核酸［2］。对有反应性的血液及其制备的所有成分报废，并将该献血者实施献血屏蔽和淘汰，为了解其真实的感染情况，我们对部分抗-HCV ELISA有反应性献血者进行补充实验和跟踪检测，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

2013年8月—2014年6月新乡市无偿献血者进行初筛实验有反应性标本44例，（初筛试剂为抗HCV ELISA间接法（上海科华和厦门新创）和双抗原夹心法（北京万泰））；2014年6月—2014年10月无偿献血者进行抗-HCV ELISA初筛试验有反应性标本28例（初筛试剂为抗HCV ELISA间接法（厦门新创）和双抗原夹心法（北京万泰））。其中抗-HCV ELISA 2次检测结果不一致的标本（单试剂阳性）36例，双试剂阳性36例，分别在其献血间隔3月、6月后电话追踪，预约静脉采样进行检测。献血者年龄18～55岁，男性占61%（44/ 72），女性占39%（28/72）。

1.2标本采集

电话预约在本站采血点采集静脉血样，留取核酸检测标本及血清学检测标本各5mL，及时分离血清/浆，并存放于-80℃冰箱保存备用。

1.3试剂与设备

①血液筛查ELISA诊断试剂：上海科华、厦门新创、北京万泰双抗原夹心试剂。所有试剂均经中国药品生物制品检定所批批检合格，并在有效期内使用。②确证试验试剂：抗-HCV重组免疫印迹试验（RIBA）：北京万泰公司产品（RC20140101）。③核酸检测试剂：上海科华生物工程股份有限公司（14042511）。④设备：RSP150全自动加样系统、EVO全自动加样系统（瑞士TECAN），FAME24/20全自动酶免处理系统（瑞士Hamilton）BEP150全自动酶免分析仪（德国贝林），HT3酶标仪，340RT温控酶标仪（奥斯帮生物工程有限公司），全自动蛋白印迹仪PROFIBLOT48（瑞士TECAN），美国ABI 7500实时荧光定量PCR扩增仪。

1.4检测方法

为了解ELISA筛查有反应性献血者的真实感染情况，我们对抗-HCV ELISA初筛试验有反应性标本分为2次检测结果不一致的标本（单试剂阳性）和双试剂阳性两组，分别对其3个月、6个月的标本采用了ELISA试验、HCV PCR检测及RIBA确证3种平衡检测方案。

1.4.1ELISA检测，对随访到的献血者均进行ELISA检测。选用不同生产厂商ELISA试剂检测2次，双试剂有反应判定为阳性，单试剂有反应再用相同试剂做双孔复查，双孔有反应或单孔有反应判定为阳性，反之判为阴性。

1.4.2HCV-RNA检测采用美国ABI7500实时荧光定量PCR扩增仪标本进行检测。结果≥103 IU/mL为阳性。1.4.3 RIBA确证试验抗-HCV RIBA确证采用重组免疫印迹实验（RIBA），未出现HCV抗体特异条带强度1+及以上判为阴性，至少出现两种HCV抗体特异条带（Core、NS3、NS4和NS5）强度1+及以上判为阳性，仅出现一种HCV抗体特异条带（Core、NS3、NS4和NS5）强度1+及以上判为不确定。

2　结果

44份标本RIBA及抗-HCV ELISA结果见表1，抗-HCV ELISA单试剂阳性标本的确证结果和NAT结果见表2，双试剂阳性献血者追踪检测结果见表3。

表1　44份标本RIBA及抗-HCV ELISA结果

2014年6月—2014年10月ELISA有反应性标本28例，其中RIBA阳性10例，RIBA不确定7例，RIBA阴性11例。

表2　36例抗-HCV ELISA单试剂阳性献血者追踪检测结果

表3　36例抗-HCV ELISA双试剂阳性献血者追踪检测结果

2　结果说明

①36例双试剂阳性标本中有20例确证阳性（55.6%），不确定11例（30.6%），阴性5例（13.9%），跟踪结果无变化。②36例单试剂阳性标本中，有1例跟踪核酸检测阳性，RIBA确证阳性，有14例RIBA不确定，经跟踪不确定结果无变化。

3　讨论

该研究跟踪的ELISA筛查有反应性献血者，分别在3个月、6个月进行相关抽样检测，旨在确保抗-HCV病毒检出前的窗口期。2001年6月召开的血液制品咨询委员会（Blood Products Advisory Committee，BPCA）会议上报告的数据证实，6个月的等待期已足以涵盖HCV感染血清阳转前的窗口期［3，4］。目前，国内大多数采供血机构未实施HCV NAT检测，更未对抗-HCV ELISA有反应性献血者作RIBA确证试验。单单由ELISA筛查“抗-HCV有反应性”屏蔽献血者，特别是一些长期献血者。容易给献血者带来心理负担，造成对无偿献血工作的误解，引起对血站的抱怨和投诉。根据表2可以看出，ELISA筛查单试剂有反应性者中有58.3%（21/36）均为潜在的合格献血者，略低于庞栋等报告的69.4%［5］，高于刘天宇等在血液筛查抗-HCV假阳性献血者回归的调查分析报道的54.88%［6］。WHO发布的《筛查献血者血液经输血传播感染的建议书》要求血站实验室开展筛查和确证试验，分别用于血液筛查和献血者管理［7］。目前美国、英国、澳大利亚等国均对此类献血者的补充实验及回招标准做了明确规定［3，4］。鉴于此，我们建议相关部门尽快出台此类献血者进一步补充实验的具体规定，明确时间间隔，规范检测流程。国外研究表明，RIBA不确定者在随访过程中一般转为阴性或者继续保持不确定结果，即判为假阳性结果［8-10］。该研究中共有25例不确定标本，在随后的跟踪检测中仍然保持不确定结果，因此，判定为假阳性。

目前多数采供血机构使用第三代国产间接法检测试剂，由于受到非特异性抗体的影响较大，易造成假阳性.随着丙肝重组抗原技术的进步，采用双抗原夹心法检测丙肝抗体的理念也得以实现，由表1可知，科华、新创、万泰3个厂家的抗-HCV有反应性标本经RIBA实验确证后，假阳性率分别为31%（5/16）、63%（10/16）、13%（2/16），万泰双抗原夹心法明显优于其他两种试剂。双抗原夹心法抗-HCV ELISA是检测抗-HCV总抗体，既缩短了“窗口期”，又可以降低间接法引起的假阳性。因此，在试剂的选择上应选择特异性和灵敏度都高的试剂，无论采用两家ELISA抗体诊断试剂筛选献血者丙型肝炎抗体或采用1种ELISA试剂检测HCV抗体，1种试剂检测HCV核酸，建议ELISA方法应选择双抗原夹心法。也希望在献血者中开展NAT和ELISA平行检测，以有效降低输血传播感染病毒的风险。

在对36例抗-HCV ELISA双试剂阳性献血者追踪检测中发现有RIBA阳性20例，NAT阳性12例。理论上，血清中即使存在1个病毒核酸分子，都能通过NAT方法检测出来，但在实际工作中，往往由于血清中病毒核酸含量太少导致核酸提取失败、PCR试剂的检测灵敏度、样本和扩增体系中可能存在某些抑制病毒核酸扩增的因素等均可能影响病毒核酸的检出［11］，但考虑到是无偿献血人群，更有可能与献血者HCV病毒血症消退等因素有关，尚需进一步进行研究。

在对36例单试剂阳性者追踪中发现有1例出现血清学转化现象，证实献血者当时处于病原体感染的窗口期，因此，对ELISA筛查单试剂阳性献血者血液实施报废处置及献血者实施6个月的屏蔽期是非常有必要的，值得引起重视。

［1］《丙型肝炎感染者调查、关护和治疗指南》.世界卫生组织. 2014年4.

［2］《血站技术操作规程》2012版.

［3］郭永健，姚凤兰，林授，等.HIV-1和HCV核酸检测血液处置和献血者屏蔽与归队指引（上），中国输血杂志，2011，24 （1）:79-85.

［4］葛红卫，林授，汪德海，等.HIV-1和HCV核酸检测血液处置和献血者屏蔽与归队指引（下），中国输血杂志，2011，24 （2）:172-176.

［5］庞栋，申卫东，张翙，等.ELISA筛查单试剂反应献血者追踪检测，中国输血杂志，2014，27（4）:381-383.

［6］刘宇宁，蔡菊英，刘晓音.血液筛查HBsAg、抗-HCV假阳性献血者归队的调查分析.中国输血杂志，2012，25（3）:260-262.

［7］WHO.Screening donated blood for transfusin-transmissible infections（Recommen dations）.Geneva，2009:50-52.

［8］Centers for Disease Control and Prevention.Recommendations for pre-vention andcontrol of hepatitis C virus（HCV）infection and HCV-re-lated chronic disease.MMWR Recomm Rep，1998，47（RR-19）:1-39.

［9］Lemaire JM，Courouce AM，Defer C，etal.HCV RNA in blood donors with isolated reactivities by third-generation RIBA. Transfusion，2000，40（7）:867-870.

［10］Stefania CMartin L.Lndeterminate third-generation hepatitis C recombinant immunoblot assay and HCV RNA analysis:isolated reactivitiy againstwith HCV viraemia in clinical patients but not bloods.Scand J Infect Dis，2005，37（6-7）: 488-492.

［11］李文新.不同方法试剂检测丙型肝炎病毒抗体结果分析.中国输血杂志，2014，27（6）:622-624.

Research on Com p lementary Experiment and Tracking Analysis of Anti-HCV and ELISA Sero-concordant and Sero-discordant Blood Donors

ZHANG Yan-mei，WANG Xin-mei，GUO Xi-biao，YUAN Shi-wen，JIANG Yan-juan，MENG Yu，WANG Fu-qiang
Xinxiang Central Blood Station，Xinxiang，Henan Province，453000 China

R7

A

1672-5654（2016）06（a）-0043-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.16.043

新乡市科技发展计划项目（项目编号：14SF13）。

张艳梅（1972.2-），女，河南新乡人，本科，副主任技师，主要从事血液检验及质量管理。

2016-03-21）