黄酮对刺葡萄花色苷辅色稳定化效果的研究

王维茜，邓洁红，2，*，田小燕，刘永红（.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙4028；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙4028；.湖南生物机电职业技术学院，湖南长沙4027）

黄酮对刺葡萄花色苷辅色稳定化效果的研究

王维茜1，邓洁红1，2，*，田小燕1，刘永红3
（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128；
2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128；3.湖南生物机电职业技术学院，湖南长沙410127）

研究了几种黄酮类物质对刺葡萄花色苷的辅色作用，并研究了槲皮素、黄芩素和芦丁对刺葡萄花色苷热稳定性的影响。结果表明：槲皮素对刺葡萄花色苷的辅色效果最为显著（p＜0.05），其次是黄芩素和芦丁，浓度为0.1 mmol·L-1时单位浓度辅色效果最佳；槲皮素和黄芩素辅色时，在pH2.0处，辅色效果最好，而芦丁辅色时，最佳pH为3.0。加入槲皮素、黄芩素、芦丁后，刺葡萄花色苷的降解速率常数（k）皆显著小于对照组，半衰期（t1/2）均显著高于对照组（p＜0.05）。经槲皮素、黄芩素、芦丁辅色后刺葡萄花色苷的活化能（Ea）分别为88.48、91.67、83.62 kJ/mol，显著（p＜0.05）高于对照组的74.51 kJ/mol，说明加入槲皮素、黄芩素、芦丁能提高刺葡萄花色苷的热稳定性。

刺葡萄花色苷，黄酮，辅色，热稳定性

花色苷作为一种天然色素安全性较高，具有特殊的芳香气味和一定的营养和药理功效，且资源丰富，是各国公认的替代合成食用色素的最理想的天然食用色素［1］。但花色苷稳定性较差，易受到亲核试剂的进攻而水解，影响花色苷稳定性的主要因素有pH、温度、浓度、结构、光、氧气、抗坏血酸、二氧化硫和辅色剂等［2-4］，使其在实际生产应用中受到限制。辅色作用包括通过共价键方式连接形成的分子内辅色和以范德华力、疏水及离子相互作用为主要驱动力的分子间辅色［5-6］。辅色法是提高花色苷稳定性的一种经济、有效的方法，通过在花色苷溶液中添加氨基酸、生物碱、类黄酮、有机酸等辅色剂来提高其稳定性［7］。与未添加辅色剂的花色苷溶液相比，辅色作用后的花色苷溶液会出现最大吸收波长向长波方向移动和吸光度值增加的现象，即红移现象和增色效应［8］。王萌等［9］研究发现DL-苹果酸、柠檬酸和酒石酸都不同程度提高了紫甘薯花色苷的热稳定性，而能与大多数色素有效辅色的阿魏酸和咖啡酸却对紫甘薯花色苷热稳定性不利，可能与紫甘薯花色苷的结构有关。李永强等［10］以浸泡型杨梅酒为模型，证明了在不同贮藏时期，黄酮含量与色调、最大吸收波长和花色苷含量呈极显著正相关。

本研究以纯化的刺葡萄花色苷（SGA）为试材，研究黄酮类物质与刺葡萄花色苷分子之间发生辅色作用的条件，比较不同黄酮类物质对刺葡萄花色苷的辅色效果，探究黄酮对刺葡萄花色苷热降解规律，为实现葡萄酒生产过程中花色苷的稳定化提供理论和应用借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺葡萄果皮 购于湖南省芷江县，洗净，晾干，手工剥皮，-40℃条件下冻藏备用；陈皮素、苦丁、槲皮素、黄芩素、葛根素、大豆素 西安旭煌生物技术有限公司；儿茶素、异甘草素 泽朗植提CPE®；柠檬酸、柠檬酸钠、无水乙醇、盐酸、冰醋酸、氯化钾 均为国药集团，分析纯。

UV-2450紫外可见分光光度计 SHIMADZU；AEY-220型电子天平 湘仪天平仪器设备有限公司；HH-8型数显恒温水浴锅 上海浦东物理光学仪器；PHS-3C型pH计 上海精科；101-2AB型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；SHB-ⅢT循环水式多用真空泵 郑州长城科工有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 刺葡萄花色苷的制备［11］称取100 g刺葡萄皮于烧杯中，以1∶6的料液比加入70%酸化乙醇（含0.03%盐酸），30℃条件下避光浸提24 h，抽滤，旋转蒸发（温度≤40℃）回收乙醇，3000 r/min离心20 min，加水稀释10倍后为后续实验用色素液，避光备用。

1.2.2 黄酮种类对刺葡萄花色苷辅色效果的影响 取5 mL色素液于具塞比色管中，分别用浓度为1.0 mmol·L-1的黄酮乙醇溶液（陈皮素、芦丁、槲皮素、黄芩素、葛根素、大豆素、儿茶素和异甘草素）定容至20 mL，混匀，避光静置24 h后，以5 mL色素液用乙醇定容至20 mL为对照，扫描450～600 nm范围内可见吸收光谱，记录最大吸收波长（λmax）和最大吸光度值（Amax），以每毫摩尔黄酮引起的刺葡萄色素溶液吸光度值的增加量（I）来考察黄酮辅色效果［12］。

式中：Amax为加入黄酮后色素溶液的最大吸光度值；A0为对照组色素溶液的最大吸光值；C为黄酮类物质的终浓度（mmol·L-1）。

1.2.3 黄酮浓度对刺葡萄花色苷辅色效果的影响 取5 mL色素液于具塞比色管中，分别加入一定量槲皮素、黄芩素、芦丁，用pH 3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至20 mL，使溶液体系中槲皮素、黄芩素、芦丁的浓度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1。避光静置24 h后，以5 mL色素液用pH3.0的缓冲液定容至20 mL为对照，测定450～600 nm范围内最大吸收波长λmax和最大吸光值Amax，计算辅色效果（I值）。

1.2.4 pH对黄酮辅色刺葡萄花色苷效果的影响 取10 mL色素液于具塞比色管中，分别加入一定量槲皮素、黄芩素、芦丁，用pH为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的缓冲溶液（pH1.0为KCl-HCl缓冲液，pH2.0为磷酸盐缓冲液，pH3.0～6.0为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液）分别定容至50 mL，使黄酮的终浓度为0.1 mmol·L-1。避光静置24 h后，以色素液中加入等量缓冲液为对照，测定λmax和Amax，计算其与对照的差值Δλmax和ΔAmax，并计算辅色效果（I值）。

1.2.5 黄酮辅色对刺葡萄花色苷热稳定性的影响 取10 mL色素液于具塞比色管中，分别加入一定量槲皮素、黄芩素、芦丁，用pH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至100 mL，使色素液中各黄酮类物质的浓度均为0.1 mmol·L-1。取加入槲皮素、黄芩素、芦丁的色素液10 mL各四份，分别置于20、40、60、80℃的水浴中避光加热，每隔2 h取样置于冰浴中迅速冷却，测定吸光值，并计算花色苷保存率。

花色苷保存率（%）=（Ax/A0）×100

其中，A0、Ax分别为520 nm处对照组的吸光度值与黄酮辅色后的吸光度值。

对刺葡萄花色苷的热处理进行热降解动力学研究，计算相应的热降解动力学参数（反应速率常数k、半衰期t1/2和活化能Ea），连续测12 h［13］。

1.3 数据处理

实验均重复3次，结果以平均值±标准差表示，数据采用SPSS软件处理。

2 结果与分析

2.1 黄酮种类对刺葡萄花色苷辅色效果的影响

表1 黄酮对刺葡萄花色苷的辅色效果Table1 Copigmentation effect of flavonoids on SGA

由表1可见，黄酮类物质均能在一定程度上增加刺葡萄花色苷的最大吸光度值，最大吸收波长均发生了红移（1.0～2.5 nm），但影响不大。黄酮类物质均能显著增加刺葡萄花色苷的最大吸光度值，但添加槲皮素、黄芩素和芦丁后的刺葡萄花色苷溶液的吸光度值与对照组相比，差异极显著（p＜0.01），增色效果更好，其中槲皮素对刺葡萄花色苷的辅色效果最为显著，其次是黄芩素和芦丁（p＜0.05）。因此选择槲皮素、黄芩素和芦丁作为辅色剂进一步研究。

2.2 黄酮浓度对刺葡萄花色苷辅色效果的影响

实验中发现，添加黄酮辅色后，刺葡萄花色苷溶液的最大吸收波长均发生了红移（1.0～2.5 nm），但红移程度并未与辅色剂浓度呈现明显的线性关系。由图1～图3可知，随槲皮素、黄芩素和芦丁浓度的增大，刺葡萄花色苷溶液的最大吸光度值逐渐增大，具有增色效应，当黄酮浓度增加到0.1 mmol·L-1时I值达到最大，辅色效果最好，此时溶液吸光度值也接近最大值。黄酮浓度为0.2 mmol·L-1吸光度值达到最大值，但辅色效果急剧减弱，原因可能是黄酮与花色苷分子结合不紧密，部分辅色基团的脱落导致吸光度值未持续升高，增加黄酮浓度，辅色基团与花色苷分子继续结合，但由于黄酮浓度为0.2 mmol·L-1时刺葡萄花色苷溶液已经完全辅色，故继续增加黄酮浓度对增色无显著作用。根据不同浓度黄酮对刺葡萄花色苷的增色效果和节约试剂成本考虑，槲皮素、黄芩素和芦丁均选择0.1 mmol·L-1浓度做后续实验。

图1 槲皮素对刺葡萄花色苷的辅色效果Fig.1 Copigmentation effect of quercetin on SGA

图2 黄芩素对刺葡萄花色苷的辅色效果Fig.2 Copigmentation effect of baicalein on SGA

图3 芦丁对刺葡萄花色苷的辅色效果Fig.3 Copigmentation effect of rutin on SGA

2.3 pH对刺葡萄花色苷辅色效果的影响

表2 pH对槲皮素辅色效果的影响Table2 Effect of pH on the copigmentation effect of quercetin on anthocyanins

表3 pH对黄芩素辅色效果的影响Table3 Effect of pH on the copigmentation effect of baicalein on anthocyanins

表4 pH对芦丁辅色效果的影响Table4 Effect of pH on the copigmentation effect of rutin on anthocyanins

pH是影响花色苷分子存在形式的主要因素，一般辅色剂在酸性条件下能与花色苷形成增色团而增强花色苷溶液的颜色及稳定性。由表2～表4可知，槲皮素、黄芩素和芦丁对刺葡萄花色苷发生了辅色作用，△λmax和△Amax有不同程度的提高，辅色效果均随pH的增加先增大后逐渐减小，pH的变化对黄酮类物质的辅色效果影响较大。槲皮素和黄芩素辅色时，在pH2.0处，I值达到最大，辅色效果最好；而芦丁辅色时，则在pH3.0处，I值达到最大。原因可能是pH＜1.0时，花色苷以黄盐阳离子的形式存在与辅色剂发生作用，而pH＞2.0时，辅色剂能同时与花色苷的黄盐阳离子和醌基形式同时作用，且有研究表明［14］，花色苷以醌碱形式存在时与辅色剂相互作用，辅色效果更强。

2.4 黄酮对刺葡萄花色苷热稳定性的影响

图4 黄酮对刺葡萄花色苷热稳定性的影响Fig.4 Effect of flavonoids on thermal stability of VSA

由图4可知，20℃时，对照组刺葡萄花色苷的保存率随时间的延长有小幅度下降，而辅色后花色苷溶液由于增色效应保存率在6 h内小幅上升，然后基本稳定，观察期内（12 h）未发现花色苷降解现象，故未计算20℃时辅色条件下的热降解参数。在40、60、80℃加热过程中，黄酮辅色后的刺葡萄花色苷保存率显著高于对照组（p＜0.05），这表明在加热条件下，黄酮对花色苷的辅色效应仍然存在，辅色作用可以提高花色苷的热稳定性。刺葡萄花色苷溶液本身及其辅色后的花色苷溶液保存率随加热温度的升高和时间的延长呈下降趋势。经槲皮素、黄芩素、芦丁辅色后的刺葡萄花色苷溶液80℃加热12 h，保存率与加热前相比，分别降低了30.87%、29.00%和35.31%，而对照组刺葡萄花色苷保存率降低了49.64%，经3种黄酮辅色后刺葡萄花色苷的热稳定性显著提高（p＜0.05）。

研究表明，加入黄酮后，刺葡萄花色苷的热降解符合一级热降解动力学［15］。由表5可知，加入槲皮素、黄芩素、芦丁后，刺葡萄花色苷的速率常数（k）皆显著小于对照组，半衰期（t1/2）都显著高于对照组（p＜0.05），如80℃条件下，对照组的半衰期为12.12 h，槲皮素、黄芩素、芦丁辅色后刺葡萄花色苷的半衰期分别为22.53、24.29、19.10 h，说明加入槲皮素、黄芩素、芦丁能提高刺葡萄花色苷的热稳定性。对照组刺葡萄花色苷的活化能（Ea）为74.51 kJ/mol，槲皮素、黄芩素、芦丁辅色后刺葡萄花色苷的活化能分别为88.48、91.67、83.62 kJ/mol，其中黄芩素活化能相比对照组提高23.03%，说明加入黄酮辅色后，刺葡萄花色苷对温度的敏感度降低。槲皮素、黄芩素、芦丁有可能作为辅色剂运用于刺葡萄花色苷溶液的热处理护色过程中。

表5 黄酮对刺葡萄花色苷热降解动力学参数的影响Table5 Kinetics parameters for the thermal degradation of SGA with flavonoids

3 讨论与结论

8 种黄酮类物质均能显著增加刺葡萄花色苷的最大吸光度值，但添加槲皮素、黄芩素和芦丁后的刺葡萄花色苷溶液的最大吸光度值与对照组相比，差异极显著，增色效果好，其中槲皮素对刺葡萄花色苷的辅色效果最为显著，其次是黄芩素和芦丁。

对于槲皮素、黄芩素和芦丁3种辅色剂，当浓度为0.2 mmol·L-1时刺葡萄花色苷溶液已经完全辅色，继续增加黄酮浓度对增色无显著作用；槲皮素和黄芩素辅色时，在pH2.0处，辅色效果最好，而芦丁辅色时，最佳pH为3.0；3种黄酮最大单位浓度辅色效果发生在0.1 mmol·L-1时。

添加槲皮素、黄芩素和芦丁，可以提高刺葡萄花色苷的活化能，延长其半衰期，从而提高刺葡萄花色苷的热稳定性。与未添加黄酮相比，0.1 mmol·L-1槲皮素、黄芩素和芦丁分别使刺葡萄花色苷的活化能（74.51 kJ/mol）提高至88.48、91.67、83.62 kJ/mol，但其辅色作用的机制还需进一步深入研究。

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Study on copigmentation effect and stability of flavonoids on spine grape anthocyanins

WANG Wei-qian1，DENG Jie-hong1，2，*，TIAN Xiao-yan1，LIU Yong-hong3
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Key Laboratory of Food Science and Biological Technology of Hunan Province，Changsha 410128，China；3.Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic，Changsha 410127，China）

The copigmentation was studied on the spine grape anthocyanins by different flavonoids.The effects of quercetin，baicalein and rutin on the thermal stability of spine grape anthocyanins were also investigated.The results showed that the most significant copigment was quercetin（p＜0.05），followed by baicalein and rutin，and the best concentration of copigment was 0.1 mmol/L-1.Quercetin and baicalein had the best copigmentation effects at pH2.0，while rutin at pH3.0.The degradation rate（k）of spine grape anthocyanins decreased after adding quercetin，baicalein and rutin，and the half-life（t1/2）were improved（p＜0.05）.The activation energy（Ea）of quercetin，baicalein and rutin were 88.48，91.67 and 83.62 kJ/mol，respectively，all significantly（p＜0.05）higher than that of the control group which was 74.51 kJ/mol.The results indicated that quercetin，baicalein and rutin could improve the thermal stability of spine grape anthocyanins.

spine grape anthocyanins（SGA）；flavonoids；copigmentation；thermal stability

TS261.4

A

1002-0306（2016）02-0318-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.055

2015－07－07

王维茜（1990-），女，硕士研究生，研究方向：农产品加工及贮藏工程，E-mail：1731686696@qq.com。

*通讯作者：邓洁红（1967-），女，教授，研究方向：园艺产品深加工理论与技术，E-mail：hongjiedeng@163.com。

国家自然科学基金（31271836）；湖南省教育厅研究生科研创新课题（CX2015B264）。