机械搅拌生物反应器的CFD模拟及剪切力对红花细胞悬浮培养的影响

张建文,　刘　禹,　夏建业,　郭美锦,　王泽建,　庄英萍

(华东理工大学生物工程学院,国家生化工程技术研究中心(上海),上海 200237)



机械搅拌生物反应器的CFD模拟及剪切力对红花细胞悬浮培养的影响

张建文,刘禹,夏建业,郭美锦,王泽建,庄英萍

(华东理工大学生物工程学院,国家生化工程技术研究中心(上海),上海 200237)

采用计算流体力学(CFD)技术模拟5 L机械搅拌生物反应器中不同搅拌转速对流场的影响,分别考察不同搅拌速度下,红花悬浮细胞培养过程中生物量、细胞活力、pH、糖耗、DO(溶解氧)、电容、电导、CER(单位体积发酵液在单位时间释放CO2的物质的量)的变化。结果表明:红花细胞对剪切环境有个适应过程,在搅拌生物反应器中悬浮培养,能够耐受剪切力值εave,CFD≤0.8 W/kg,细胞可以适应剪切环境,细胞活力能够恢复,结束延滞期快速积累生物量; 当剪切力εave,CFD>0.8 W/kg时,细胞不能耐受剪切环境,受到较大损伤,导致细胞活力很低,裂解死亡。

植物细胞悬浮培养; 剪切力; 生物反应器; CFD模拟

植物细胞培养是生物合成次级代谢物的重要途径之一。由于植物细胞个体较大,胞内含有占体积很大比例的大液泡,使细胞对物理剪切压力很敏感,其对剪切力的敏感性远大于微生物。由于通气和搅拌的原因,植物细胞在反应器中培养是完全处于流体压力下[1],在流体压力的影响下,植物细胞的生长速率和次级代谢物合成的速率往往受到影响[2],而且不同的植物细胞系对流体压力响应程度有一定的差别。大豆细胞在摇瓶培养中受到机械应力或大力搅拌条件下,会出现氧迸发现象[3]; 水母雪莲细胞在倾斜式搅拌桨反应器中培养,流变压力使细胞聚集体分裂,影响细胞生长及黄酮合成量的下降[4]; 南方红豆杉细胞在Couette式剪切反应器中培养,会导致细胞生物活性丧失较大,酚类物质大量积累,产生防御应答反应[5]。

关于剪切力对植物细胞悬浮培养的影响,有研究只是在特定流场反应器如Couette式剪切反应器中考察植物细胞的离线生理参数[5],而在实际的反应器培养中剪切力和细胞生理响应之间的关系和在线仪器仪表在植物悬浮培养中的运用是值得进一步研究的问题。

本文采用搅拌式生物反应器培养红花悬浮细胞,通过计算流体力学(CFD)软件,模拟不同转速下反应器流变特性,直观反映反应器内剪切力分布,并且经计算确定反应器中单位体积能量耗散率ε的数值,以及在线溶氧电极、活细胞电极和过程尾气质谱仪的应用,在此基础上考察不同剪切环境对红花细胞的生长、代谢和生物活性的相关性分析,以期为植物细胞悬浮培养的放大和适合植物细胞悬浮培养反应器设计的研究提供参考。

1　材料和方法

1.1主要仪器和设备

本研究采用5 L搅拌式生物反应器(上海国强生化设备有限公司),如图1所示,罐体底部呈中凹形,罐体直径DT为160 mm,罐体容量V为5 L,装液量VL为3 L,液面高度H为162 mm,挡板长度L为140 mm,挡板宽度W为15 mm,桨叶直径D为72 mm,桨间距Ci为80 mm,桨叶与罐底距离Cb为40 mm;溶氧电极(梅特勒-托利多,瑞士)在线监控溶氧;活细胞电极(Aber-instruments,英国)在线测定电容和电导;pH电极离线测定pH。

1.2细胞系和培养基

培养基为MS(Murashige and Skoog)培养基(萘乙酸(NAA)2.5 mg/L,6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.2 mg/L,蔗糖30 g/L,pH=6.5)。细胞系为红花植物细胞株系,由大连普瑞康生物科技有限公司提供。

图1　生物反应器简图Fig.1　Schematic diagram of the bioreactor

1.3实验条件

红花细胞在1 000 mL摇瓶中培养7 d,然后接种到5 L的机械搅拌生物反应器中,接种体积比为1∶4,转速设置分别为100、200、300、400 r/min,在25 ℃条件下培养。

1.4实验参数的设定

1.4.1细胞生物量每隔24 h从发酵罐内取一次25 mL发酵液,用于实验参数的测定(下同)。

称取烘干的孔径为8 μm的滤膜,充分混匀发酵液,吸取5 mL,抽滤1 min后,称重,然后在40 ℃烘箱中烘24 h,称量得干重。

1.4.2发酵液中糖的测定取发酵液上清,稀释5倍,采用HPLC (1290,安捷伦)测定发酵液中糖浓度[6]:色谱柱为Shodex Asahipak NH2P-50 4E,流动相为乙腈-水(VC2H3N∶VH2O=3∶1),流速为1.0 mL/min,柱温30 ℃; 蒸发光检测器(Altech 3300ELSD),载气为高纯氮气,流速1.5 mL/min,漂移管温度为80 ℃。

1.4.3细胞线粒体活性测定发酵液中细胞经8 μm滤膜抽滤后在试管中加入200 mg湿重红花细胞、2.5 mL质量浓度为4 g/L的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液、2.5 mL 0.1 mol/L(pH 7.0)Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液,混匀后,25 ℃下暗处理13～16 h,离心弃上清液,蒸馏水洗涤3次,加入5 mL甲醇,置于60 ℃水浴50 min,期间轻摇动数次,静置室温至细胞无色,离心后取上清液稀释2倍,在分光光度计485 nm处测定吸光度值A[7]。

1.4.4发酵罐在线采集数据采用Biostar采集系统对发酵罐中的DO(发酵液中溶解氧)、CER(单位体积发酵液在单位时间释放CO2的物质的量)在线采集。

1.4.5CFD模拟CFD模拟是由软件Fluent 12(ANSYS Inc.)计算,采用单相流体计算,多参考系模型模拟叶轮旋转。采用标准k-ε湍流模型结合标准壁面函数双方程,多参考旋转坐标,SIMPLE算法计算,压力速度耦合,用二阶迎风分格式离散模型表征空间离散化。网格的几何模型由ANSYS ICEM计算。

2　结果与讨论

2.1CFD结果验证

搅拌生物反应器中桨叶产生的单位体积能量耗散率ε引用公式(1)计算[8],测定功率输入及相关经验参数[8]由公式(2)计算获得,桨叶雷诺数由公式(3)得到[9]。

(1)

(2)

(3)

式中;N为搅拌速率;D为桨叶直径;VL为发酵液体积;M为扭矩;μL为黏度;ρL为密度;P为功率输入;Re为雷诺数。

根据经验式(1)、(2)、(3)和桨叶间距与桨叶直径比值修正后的参考系数εave,emp[8]结果见表1,在不同搅拌转速下,εave,CFD计算结果与εave经验公式相接近,由于经验公式计算没有考虑小涡流产生的能量耗散率ε,两者会有一定的差值,而且εave,CFD应用的k-ε方程计算的准确度高于85%,所以εave,CFD模拟值可信。

表1　模拟值与经验值对比

经过以上设计,对不同转速下5 L反应器内剪切速率进行模拟分析。计算结果如图2所示。

图2　不同转速下模拟搅拌反应器内部剪切速率分布图Fig.2　Shear rate distribution in a simulated bioreactor under different agitation speeds

通过剪切速率分布图可以看出,在桨叶尖端速度最大,由于上下两层搅拌桨产生的流速场交叉,使得每个搅拌桨形成的环流区非常明显。通过以上模拟分析可知,在不同搅拌转速下,反应器内的流场强度不同,搅拌转速越大,流场强度越大。

2.2不同搅拌转速对红花细胞生长的影响

红花细胞接种至生物反应器中,细胞对流场剪切力有个适应过程,细胞受到剪切力作用,造成细胞损伤,影响细胞形态(如细胞团形态变小、部分细胞可能会裂解等)。如图3所示,在100 r/min转速时,εave,CFD=0.029 7 W/kg,细胞所受剪切力作用较小,延滞期相对较短,在100 h左右开始进入对数生长期,生物量最终达到13.51 g/L; 随着转速提高,εave,CFD计算值大幅度提高,200 r/min转速时,εave,CFD为0.194 5 W/kg,是100 r/min条件下的6.5倍,细胞生长延滞期延长,120 h左右开始进入对数生长期,最大生物量为11.31 g/L; 300 r/min转速时,εave,CFD=0.825 2 W/kg,细胞延滞期进一步延长至150 h左右,最大生物量为8.67 g/L; 而在400 r/min转速下,εave,CFD=1.741 1 W/kg,细胞完全不耐受剪切,细胞生长缓慢,干重一直处于很低水平。

搅拌速率是成功建立植物细胞悬浮培养体系的一个重要参数[10]。适当的搅拌速率能够加强营养物质从气液接触面向细胞传递以及分散气泡加强氧传递,所以能够促进细胞更好地生长和次级代谢物的合成[10]。但是由于细胞的粒径、较厚的细胞壁、胞内大液泡、搅拌和通气等因素的存在,当细胞处于剪切力时,表现出生理和形态上的变化,比如细胞成团、细胞完整性、活力、生物量的积累,次级代谢产物等均不同[11]。随着搅拌转速的提高,反应器流场中εave,CFD值大幅度提升,剪切力越大,红花细胞生长的延滞时间越长,最终生物量也越低。当εave,CFD≤0.8 W/kg时,红花细胞能够耐受流场剪切环境; 当εave,CFD>0.8 W/kg时,红花细胞不能够耐受剪切。

图3　不同搅拌转速下红花细胞生长变化曲线Fig.3　Growth curves of suspension cultures of Carthamustinctorius under different agitation speeds

2.3不同搅拌转速下细胞活性的变化

细胞活性可以表明细胞在适合的环境中生长和分裂的能力,通常活性与离子不可渗透的细胞膜的存在相关[12]。采用TTC法测定活细胞中酶活,可以直接反映红花细胞活力。图4表明在不同转速条件下,生物反应器内不同的单位体积能量耗散率ε对细胞造成不同程度的损伤,εave,CFD值越大,细胞活力下降速度越快,细胞活力最低值越小,而且细胞活力恢复时间延长,细胞在生长后期活性恢复达不到起始水平,在400 r/min转速下,由于εave,CFD值太大,细胞活性无法恢复,与细胞生长曲线相对应。商桂敏等[13]利用同轴圆筒反应器研究剪切应力对红豆杉细胞活性的影响,发现高转速下细胞活力快速下降。

图4　不同搅拌转速对红花细胞活力的影响Fig.4　Effect of shear stress on the mitochondrial activity of suspension culture under different agitation speeds

起始阶段细胞处于延滞期阶段,活力逐渐下降,处于不同生长阶段的细胞对剪切的耐受程度不同,会导致部分细胞膜的破裂或者细胞裂解死亡。当细胞延滞期结束时,细胞的整体活性都会出现回升,表明细胞开始进入生长阶段。

2.4不同搅拌转速下培养基pH变化

在植物细胞悬浮培养过程中,起始pH一般出现下降现象,延滞期结束时pH开始回升。如图5所示,在4个不同转速条件下,红花细胞悬浮培养过程中,开始pH均出现快速下降现象,但是当εave,CFD值较低时,在对应的100、200、300 r/min转速下,发酵液pH都有不同程度的回升,这与细胞生长曲线和活力变化曲线相对应,400 r/min转速时,εave,CFD较大,细胞不能承受剪切力损伤,pH持续保持较低水平。Meijer等[12]认为细胞悬浮液发生酸化作用是遭受剪切力伤害的植物细胞所作出的共同反应,导致pH下降的胞内化合物的释放可作为细胞受到剪切力损伤的标志[14],当生物反应器内发酵液pH开始回升时,可以表明悬浮红花细胞开始正常生理代谢生长。

图5　不同搅拌转速下培养基pH变化曲线Fig.5　Curvs of pH in culture medium under different agitation speeds

2.5不同转速下培养基中碳源的消耗

蔗糖是植物悬浮培养中最为常用的一种碳源,侯学文等[15]发现蔗糖为玫瑰茄细胞生长的最适合的碳源; Sivanandhan等[16]对南非醉苆悬浮培养的研究表明一定浓度的蔗糖相比于葡萄糖、麦芽糖对细胞生长有利。如图6所示,红花细胞培养过程中,蔗糖被快速分解成葡萄糖和果糖,葡萄糖浓度消耗速度明显快于果糖,说明红花细胞生长优先消耗葡萄糖。在100、200、300 r/min转速下,红花细胞能够耐受3种转速下的剪切力,总糖耗曲线与生长曲线相对应,细胞进入指数生长阶段,相对应的糖耗速度也加快; 400 r/min转速时产生的剪切力对红花细胞损伤较大,细胞活性持续很低,糖耗速度也很慢。随着培养环境剪切力的提高,蔗糖的分解速度反而加快,这可能与细胞受到剪切环境影响加快蔗糖水解产能作为一种防御措施有一定关联。

图6　不同搅拌转速下红花细胞培养基糖浓度变化Fig.6　Change in sugar concentration of suspension culture under different agitation speeds

2.6不同转速下培养基电容和电导率的变化

在线活细胞传感仪利用电容的原理,可以用于细胞、酵母菌、放线菌、霉菌、植物细胞、动物细胞培养过程中活细胞浓度的准确测定[17]。Markx等[18]在植物高羊茅细胞悬浮培养中采用电容原理,监控细胞的生长; Tanja等[19]将在线监控与常规测量生物量方法对比,判定活细胞电极在线检测植物细胞生物量更加合理。

从图7电容与电导的变化可以直观地看出红花细胞在不同剪切环境中的活力和生长变化,在100、200 r/min转速下,细胞培养环境εave,CFD较小,细胞能够耐受剪切力,活细胞数量没有下降,电容呈上升趋势; 在300、400 r/min转速下,细胞培养环境εave,CFD较大,高剪切作用下,细胞起始阶段受到损伤,活细胞数量下降,电容相应地随之有所下降。低剪切环境,电容增长曲线与细胞干重增长曲线相吻合,但是在培养后期电容与干重变化出现分离,说明细胞活力不足,细胞可能出现细胞膜破裂,干重虽然还有所增加,但是活细胞数量开始减少。Tanja等[19]应用活细胞电极技术在线检测植物细胞搅拌反应器中悬浮生长情况,在生长后期也出现类似现象。

电导的变化可以反映发酵液中离子浓度的变化,在细胞度过延滞期开始生长的阶段,电容开始回升,培养基中盐离子逐渐被细胞吸收利用,相应的电导率也开始下降。从电容和电导率的变化,可以更加科学地反映细胞的生长变化和活性变化。

2.7不同搅拌转速下生物反应器中CER、DO的变化

红花细胞在反应器悬浮培养过程中的CER、DO均由Biostar采集软件计算获得。如图8所示,红花细胞接种至搅拌反应器中,细胞长期处于延滞期生长阶段,不同的εave,CFD值下,细胞所处延滞期时间不同,相应的DO值下降趋势也有所不同。高εave,CFD环境,反应器内DO值下降缓慢,溶氧快速消耗与细胞生长一致; 低εave,CFD环境下,反应器内DO值下降较快,溶氧快速下降时间节点与细胞指数生长相一致。由于红花细胞代谢缓慢,细胞呼吸强度较弱,整个培养阶段的CER在10 mmol/(L·h)以内,而且不同转速对应不同εave,CFD值,CER上升趋势总体与细胞生长趋势相同,而且在细胞生长后期,细胞活性下降,代谢变缓,相应的CER也开始下降。Dong等[20]在反应器中培养人参悬浮细胞,比耗氧速率SOUR(单位细胞单位时间耗氧量)与干重生长曲线比较,得出在SOUR达到最大值时,比生长速率变缓。

图7　不同搅拌转速下红花细胞培养过程电容、电导变化Fig.7　Time course of capacitance and conductivity of cell suspension culture under different agitation speeds

图8　不同搅拌转速下红花细胞培养过程DO、CER的变化Fig.8　Time course of DO concentration and CER of cell suspension culture under different agitation speeds

3　结　论

搅拌转速是产生剪切力的主要因素,红花细胞在搅拌生物反应器中悬浮培养时,应用CFD技术模拟不同转速下反应器中流场剪切力的分布,计算εave,CFD值,直观反映出反应器中剪切力的大小,考察细胞在不同剪切环境中的生长代谢情况,得出红花细胞耐受剪切力值εave,CFD≤0.8 W/kg。植物细胞在大型搅拌反应器中高密度放大悬浮培养,可以通过此方法,确定植物细胞耐受的最大剪切力εave,CFD值,以期指导反应器的设计、桨叶类型的选择以及培养条件(转速、通气量)的控制等。

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CFD Simulation of a Mechanically Stirred Bioreactor and Effect of Shear Stress on Suspension Cultures of Carthamus tinctorius

ZHANG Jian-wen,LIU Yu,XIA Jian-ye,GUO Mei-jin,WANG Ze-jian,ZHUANG Ying-ping

(National Engineering Research Center of Biotechnology (Shanghai),School of Biotechnology,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

The effect of agitation speed on agitation current field was studied in 5 L mechanically stirred bioreactor by computational fluid dynamics (CFD) method.Safflower (Carthamustinctorius) cells were cultivated in stirred tank reactor under different agitation speeds.The resultant changes in the cells were evaluated on the basis of biomass,cell viability and change of fermentation liquor about pH,sugar concentration,DO,capacitance,conductivity and CER.Results showed that there was an adaptive process of cell cultured in the shear flow field.To a certain extent,cells were able to tolerate the shear force in mechanically stirred bioreactor withεave,CFD≤0.8 W/kg.Under this shear flow field,the lag phase was shorter,and the speed of biomass accumulation and recovery of cell activity was faster.Ifεave,CFD>0.8 W/kg,cells couldn’t tolerate the shear force,because it was not easy for cells to recover cell activity,and even cells were lysised after suffering from damnification.

plant cell suspension culture; shear force; bioreactor; CFD simulation

1006-3080(2016)04-0492-07

10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.04.009

2015-12-21

国家973项目(2013CB733600);国家高技术研究发展(863)计划(2015AA021005)

张建文(1991-),男,山东人,硕士生,研究方向为发酵工程方向。E-mail:jiawenhate@163.com

通信联系人：庄英萍,E-mail:ypzhuang@ecust.edu.cn

Q815

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