淫羊藿苷通过增强Fas-FasL表达活性诱导裸鼠食管癌细胞凋亡*

纪　昕，王　崇，李　洁，岳晓乐，张艳华，李永军△

(1.河北医科大学第二医院检验科,石家庄 050000；2.河北医科大学第四医院科研中心,石家庄 050011；3.河北省辛集市第一医院检验科　052300)



论著·基础研究

淫羊藿苷通过增强Fas-FasL表达活性诱导裸鼠食管癌细胞凋亡*

纪昕1，王崇1，李洁2，岳晓乐1，张艳华3，李永军1△

(1.河北医科大学第二医院检验科,石家庄 050000；2.河北医科大学第四医院科研中心,石家庄 050011；3.河北省辛集市第一医院检验科052300)

目的探讨淫羊藿苷(icariin，ICA)对裸鼠体内食管癌移植瘤生长的抑制作用，并初步探讨其机制。方法应用MTT方法和Giemsa染色法检测和观察ICA对食管癌细胞Eca-109和TE-13的体外抑制作用。构建裸鼠的食管癌细胞移植性肿瘤模型，分为3组，每组6只。实验组每只裸鼠腹腔注射50 mg/kg ICA，对照组注射相同体积的生理盐水，阳性对照组腹腔注射2 mg/kg顺铂，每2天1次，共14 d，每3天测量肿瘤体积，实验结束后称量肿瘤质量；TUNEL染色法观察各组裸鼠肿瘤组织的组织形态变化和凋亡情况；免疫组织化学法对肿瘤组织中Fas和FasL蛋白的表达变化进行分析。ELISA法检测外周血中FasL和IFN-γ的水平。结果ICA体外对食管癌细胞Eca-109和TE-13的增殖无明显的抑制作用。实验组和阳性对照组裸鼠肿瘤平均体积和质量与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。TUNEL染色法结果显示，实验组裸鼠的肿瘤组织发生了明显的凋亡，凋亡细胞的数量较对照组明显增加(P<0.05)。免疫组织化学实验结果表明，与对照组相比，实验组裸鼠肿瘤组织中Fas、FasL的表达明显增加(P<0.05)。ELISA实验结果显示，实验组裸鼠外周血中FasL和IFN-γ的水平较对照组明显增高(P<0.05)。结论ICA体外对食管癌细胞无明显增殖抑制作用，但是通过Fas的表达、FasL和IFN-γ的分泌在体内诱导食管癌细胞凋亡，从而发挥抗食管癌的作用。

淫羊藿苷；食管肿瘤；Fas-FasL；细胞凋亡

食管癌是危害我国民众健康最为严重的恶性肿瘤之一，依据2014年世界卫生组织最新统计结果，食管癌发病率在我国恶性肿瘤中居第5位，病死率居第4 位。2014年中国死于食管癌的人数约为197 400例，超过全世界食管癌总死亡人数的一半[1]。放射治疗与化学治疗对某些患者确实有效，也挽救了部分患者的生命，但有明显的毒副作用，长期服用易造成患者免疫系统、消化系统和其他重要器官的严重损害，导致患者承受巨大的痛苦，生存质量下降[2]。因此，寻找能够协同或者代替放射治疗与化学治疗，确保治疗效果，同时减低毒副作用的药物是科研工作者长期而艰巨的任务。近年来，植物制剂及其衍生物的应用在癌症治疗中发挥巨大作用[3-9]。淫羊藿为补益类中药，具有温肾壮阳，强筋骨，祛风湿的功能，体内外研究发现，淫羊藿的主体成分淫羊藿苷(icariin，ICA)具有良好的抗肿瘤和免疫调节活性[10-13]。本研究通过构建裸鼠食管癌移植瘤模型，并以生理盐水和ICA分别处理裸鼠，监测肿瘤的成瘤情况和生长状况，并在肿瘤组织中检测相关蛋白的表达水平，探讨ICA对食管癌细胞的增殖和凋亡的影响，以期探索将ICA作为抗食管癌药物的可能性。

1　材料与方法

1.1实验材料ICA购自美国Sigma公司，生产批号：MKBR8091V，纯度大于96%，胎牛血清和RPMI1640培养基购自Gibco-BRL公司，MTT和TUNEL染色试剂盒购自美国Promega公司，Giemsa染色试剂盒购自Baso公司，二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，IFN-γ和FasL的ELISA试剂盒购自伊莱瑞特(Elabscience)生物科技有限公司，兔抗鼠Fas、FasL一抗体购自Santa Cruz公司，SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.2实验动物及分组BALB/c型裸鼠，18只，5～6周龄，体质量(20.2±0.7)g，雄性，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在河北医科大学第四医院动物实验中心饲养，实验动物使用许可证号SYXK(冀)2013-0051。动物实验研究经动物管理使用委员会和伦理委员会批准。实验组裸鼠每只腹腔注射浓度10 mg/mL ICA 100 μL，给药剂量为50 mg/kg，对照组注射相同体积的生理盐水，阳性对照组腹腔注射顺铂(2 mg/kg)，每2天1次，共14 d，每3天测量肿瘤体积，实验结束后称量肿瘤质量。按公式计算肿瘤体积：肿瘤体积=(1/2×长×宽2)。25 d后处死裸鼠并称量肿瘤质量。

1.3细胞培养食管癌细胞系TE-13、Eca-109细胞由上海科学院细胞生物研究所提供。所有细胞系培养于10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，于37 ℃、5% CO2条件下培养。以0.25%的胰蛋白酶消化细胞并传代，每1～2天换液1次，取对数生长期的细胞用于实验。

1.4细胞活力检测

1.4.1应用MTT方法检测10、50、100 mg/mL ICA对食管癌细胞Eca-109和TE-13增殖能力的影响于96孔板中加入1×104细胞并培养48 h，每孔加10 mg/mL MTT 10 μL并于37 ℃ 孵育3 h，然后移除上清液，加入150 μL DMSO并于室温轻轻摇晃15～20 min。用全自动定量酶标仪在波长492 nm处测定吸光度(A)，以上实验结果重复3遍。ICA对食管癌细胞增殖的作用以细胞增长抑制率表示，用公式表示：抑制率=[(对照组A值-实验组A值)/对照组A值]×100%。

1.4.2应用Giemsa染色法观察100 mg/mL ICA对食管癌细胞Eca-109和TE-13的体外抑制作用分别制备对照组和实验组肿瘤细胞涂片，干燥后于涂片上滴加A溶液0.5～0.8 mL，染液覆盖整个涂片染色1 min，滴加B溶液于A溶液上，滴加量约为A溶液2倍，以洗耳球吹匀后染色5～10 min，蒸馏水冲洗、干燥后显微镜观察细胞。

1.5裸鼠种植性肿瘤模型的建立、治疗及标本处理于BALB/c型裸鼠右侧肩胛下注射0.1 mL TE-13细胞(含2×106个细胞)，当肿瘤体积增长到约50 mm3，裸鼠被分为3组，每组6只。

1.6TUNEL染色法检测细胞凋亡裸鼠移植瘤石蜡切片5 μm，二甲苯脱蜡，PBS冲洗，胰蛋白酶消化，PBS冲洗；加TUNEL反应液37 ℃ 孵育60 min，PBS冲洗；加过氧化物酶抗体37 ℃ 孵育30 min，PBS冲洗；滴加二氨基联苯胺(DAB)，室温孵育10～30 min，PBS冲洗；封片、烘干，光镜下观察细胞核中有棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。

1.7免疫组织化学检测组织Fas、FasL蛋白表达水平将裸鼠移植瘤制成石蜡切片，按免疫组织化学试剂盒说明书所述方法检测Fas、FasL蛋白的表达情况。FasL抗体按 1∶100 稀释，生物素化山羊抗兔二抗和辣根过氧物酶标记的链霉卵白素(三抗)为试剂盒中的原液。DAB试剂显色后，用苏木素对比染色，中性树胶封片，光镜下观察结果。

1.8ELISA方法检测外周血FasL和IFN-γ表达水平通过摘眼球法取各组小鼠外周血液，凝集离心后取血清100 μL,用ELISA 试剂盒测定FasL和IFN-γ水平,操作步骤按产品说明书进行,在酶标测试仪上测定570 nm 处A值。根据标准曲线计算出外周血液中FasL、IFN-γ的水平。

2　结　　果

2.1ICA对食管癌细胞增殖的抑制作用不同浓度的ICA处理食管癌细胞TE-13和Eca-109 48 h后，用MTT实验检测细胞的活性，研究结果显示无毒剂量的10、50、100 mg/mL ICA对食管癌细胞系TE-13、Eca-109细胞的增殖无明显影响，见图1；且细胞形态未发生明显的改变。

图1　　ICA对食管癌细胞增殖抑制作用

A：对照组；B：实验组。

图2TUNEL染色显示荷瘤裸鼠移植瘤的凋亡情况(×200)

2.2ICA体内抑制肿瘤的形成ICA能明显抑制食管癌细胞在体内的生长，见图2。肿瘤细胞接种11 d后，对照组裸鼠的肿瘤体积开始增加，生长速度较快，而实验组裸鼠肿瘤体积增长缓慢。实验结束后，实验组裸鼠的肿瘤平均体积和质量为(0.55±0.12)cm3、(0.32±0.09)mg，小于对照组的(0.91±0.35)cm3、(1.56±0.15)mg，差异有统计学意义(P<0.05)，阳性对照组的(0.42±0.13)cm3、(0.26±0.06)mg，与对照组相比差异也有统计学意义(P<0.05)，实验组和阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3ICA促进体内肿瘤细胞凋亡对两组荷瘤裸鼠的肿瘤组织进行TUNEL染色。研究结果显示，对照组裸鼠肿瘤组织内细胞核蓝染，少见阳性凋亡细胞，实验组小鼠肿瘤组织内可见阳性凋亡细胞，且细胞数量明显高于对照组。见图2。

2.4ICA体内调控肿瘤组织Fas和FasL蛋白的表达对两组荷瘤裸鼠肿瘤组织进行免疫组织化学染色。Fas蛋白和FasL蛋白阳性染色定位于食管癌细胞的细胞质，呈棕黄色颗粒状分布。与对照组相比，ICA能够升高Fas蛋白的表达水平，同时升高FasL的表达水平。见图3。

2.5ICA对裸鼠体内血清FasL和IFN-γ分泌的影响与对照组比较，实验组小鼠外周血FasL和IFN-γ水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.05),见图4。

A：对照组Fas；B：实验组Fas；C：对照组FasL；D:实验组FasL。

图3裸鼠移植瘤组织中Fas和FasL蛋白的表达水平(免疫组织化学×200)

a：P<0.05，与对照组比较。

图4荷瘤裸鼠外周血中IFN-γ和 FasL的分泌水平

3　讨　　论

淫羊藿来源于小檗科多年生植物淫羊藿属的多种植物,为传统的补虚壮阳中药。近年研究表明,从淫羊藿中分离的黄酮类化合物ICA具有刺激机体免疫系统和刺激骨髓DNA合成的,增加外周血白细胞数量、骨髓造血干细胞中粒单系祖细胞数量等的功能，增强机体免疫功能。有文献报道，100 mg/mL ICA能够诱导肝癌HepG2.2.15细胞分化凋亡，抑制肝癌细胞和Hela细胞的生长[14]，中剂量ICA可以促进H22肝癌移植瘤小鼠细胞凋亡[15]。本实验进一步研究了ICA在体内外对食管癌细胞的抑制作用，结果显示用10、50、100 mg/mL浓度ICA体外处理食管癌细胞48 h后，对细胞的增殖无显著影响，分析原因可能由于浓度较小未对食管癌细胞产生影响，但分别用生理盐水和ICA处理小鼠25 d后，实验组裸鼠肿瘤的平均体积和质量显著降低；进行肿瘤组织的TUNEL染色，结果显示ICA可明显诱导肿瘤组织内的细胞发生凋亡，ICA (50 mg/kg)可明显降低裸鼠体内的肿瘤负荷。

凋亡的发生与基因表达、蛋白质合成和细胞内Ca2+浓度的增高等多种生物行为有关，有不同的信号传导系统介导和参与，其中Fas-FasL可直接启动细胞凋亡的信号途径，是介导细胞凋亡最为重要的跨膜蛋白分子[16-17]。正常情况下，肿瘤细胞表达Fas，T淋巴细胞在肿瘤抗原刺激和辅助性T淋巴细胞作用下活化、增殖，表达FasL，两者结合后，带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD可以激活Caspase基因，继而激活下游半胱氨酸蛋白酶超家族系列成员，级联反应促使Fas蛋白所在细胞发生凋亡就可能诱导肿瘤细胞凋亡。但是由于肿瘤细胞不表达、低表达或表达无功能的Fas[18]，亦或由于肿瘤细胞编码的Caspase基因发生点突变，信号传导机制产生缺陷，不能继续向下传递凋亡信号，肿瘤细胞不发生凋亡就可能导致杀伤机制不能正常进行。IFN-γ是一种由激活免疫细胞分泌的细胞因子，具有直接抗肿瘤活性，或通过激活巨噬细胞产生细胞毒作用。Ⅰ型、Ⅱ型干扰素都具有调节和增强肿瘤细胞对Fas介导的细胞凋亡的敏感作用。干扰素通过调节Fas-FasL信号通路诱导细胞凋亡是近年来肿瘤免疫学研究热点之一，IFN-γ可以通过干扰素受体上调肿瘤细胞的Fas水平和淋巴细胞的FasL水平或影响Fas介导肿瘤细胞凋亡敏感性加强该肿瘤免疫途径，其可能机制是IFN-γ通过调控抗凋亡基因bcl-2家族、白细胞介素1β相关酶ICE基因、Caspase家族等相关基因而发挥作用。在本研究中，ICA可提升外周血中FasL和IFN-γ的分泌，并升高肿瘤组织内Fas和FasL的表达水平，这可能是ICA发挥抗肿瘤作用的重要机制之一。

迄今为止，恶性肿瘤的治疗多为手术切除为主，放射治疗、化学治疗为辅的传统方法，手术可以遏制肿瘤的继续发展，但容易引起并发症，如出血、术后感染、切口粘连等，且术后的复发率也较高。而放射治疗和化学治疗在杀死癌细胞的同时也不可避免地损伤正常细胞，毒副作用往往很大，而ICA是在中医配方中广泛出现的补益类中药，将可能成为一种潜在的安全的抗癌药物。但是ICA抗肿瘤机制还需要进一步研究和探讨，解决此问题将有助于进一步研究ICA的功能和作用机制，为ICA用于肿瘤的治疗提供理论基础。

[1]Enzinger PC,Mayer RJ.Esophageal cancer[J].N Engl J Med,2003,349(23):2241-2252.

[2]Hou J,Liao LD,Xie YM,et al.DACT2 is a candidate tumor suppressor and prognostic marker in esophageal squamous cell carcinoma[J].Cancer Prev Res (Phila),2013,6(8):791-800.

[3]Mawhinney MR,Glasgow RE.Current treatment options for the management of esophageal cancer[J].Cancer Manag Res,2012,4:367-377.

[4]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[5]Zhao L,Yan X,Shi J,et al.Ethanol extract of Forsythia suspensa root induces apoptosis of esophageal carcinoma cells via the mitochondrial apoptotic pathway[J].Mol Med Rep,2015,11(2):871-880.

[6]Liu GX,Wang TT,Hu WJ,et al.Anticancer effect of ethanol extract of Fructus Forsythiae on primary cancer cells isolated from ascites and pleural fluids[J].Practical Geriatrics,2009,23(5):359-363.

[7]王彩霞，殷海涛,刘宝瑞.连翘三萜类化合物对前列腺癌PC-3细胞增殖抑制及放疗敏感性的[J].山东医药,2011,51(45):25-27.

[8]雷秋香，赵连梅，颜晰，等．连翘叶乙醇提取物对人食管癌细胞增殖抑制作用的研究[J]．肿瘤防治研究，2012，39(4)：394-399．

[9]颜晰，赵连梅，孙佳玮，等．连翘提取物体外抗肿瘤活性的初步研究[J]．癌变·畸变·突变，2012，24(1)：20-24．

[10]Li X,Sun J,Hu S,et al.Icariin induced B16 melanoma tumor cells apoptosis,suppressed tumor growth and metastasis[J].Iran J Public Health,2014,43(6):847-848.

[11]Wang Z,Ding L,Zhang S,et al.Effects of icariin on the regulation of the OPG-RANKL-RANK system are mediated through the MAPK pathways in IL-1β-stimulated human SW1353 chondrosarcoma cells[J].Int J Mol Med,2014,34(6):1720-1726.

[12]赵连梅，纪昕，潘晓明，等．淫羊藿苷(ICA)对化疗后免疫抑制小鼠的免疫促进作用[J]．中国免疫学杂志，2009，25(12)：1092-1095.

[13]赵连梅，纪昕，单保恩，等．淫羊藿苷对化疗后小鼠骨髓和细胞免疫抑制作用的影响[J]．细胞与分子免疫学杂志，2010，26(10)：976-979．

[14]王谦，张玲，毛海婷，等．中药淫羊藿苷逆转肝癌HepG2.2.15细胞恶性表型及诱导分化研究[J]．世界华人消化杂志，2007，15(19)：2087-2092．

[15]李翠玲，张玲，顾洪涛，等．淫羊藿苷体内抑瘤作用及其机制[J]．中国肿瘤生物治疗杂志，2007，14(2)：137-142．

[16]Wurzer WJ,Ehrhardt C,Pleschka S,et al.NF-kappaB-dependent induction of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and Fas/FasL is crucial for efficient influenza virus propagation[J].J Biol Chem,2004,279(30):30931-30937.

[17] Reichmann E.The biological role of the Fas/FasL system during tumor formation and progression[J].Semin Cancer Biol,2002,12(4):309-315.

[18]Elnemr A,Ohta T,Yachie A,et al.Human pancreatic cancer cells disable function of Fas receptors at several levels in Fas signal transduction pathway[J].Int J Oncol,2001,18(2):311-316.

Icariin induces apoptosis of esophageal cancer cell through enhancing Fas-FasL expression activity*

JiXin1,WangChong1,LiJie2,YueXiaole1,ZhangYanhua3,LiYongjun1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050000,China;2.ScientificResearchCenter,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversit,Shijiazhuang,Hebei050011,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,XinjiMunicipalFirstHospital,Xinji,Hebei052300,China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of icariin(ICA) on the xenograft tumors growth of esophageal carcinoma and to preliminarily investigate its mechanism.MethodsThe MTT assay and Giemsa staining were applied to detect and observe the in vitro inhibitory effect of ICA on esophagus cancer cell lines Eca-109 and TE-13.The xenograft tumor model of nude mouse esophagus cancer cell was constructed and divided into 3 groups,6 cases in each group.Each mouse in the experimental group was intraperitoneally injected by ICA 50 mg/kg;while the control group was injected by the same volume of normal saline and the positive control group was injected by cis-platinum 2 mg/kg,once every 2 days,a total of 14 days.The tumor volume was measured once per 3 d.After experiment,the tumor weight was measured;the TUNEL staining was used to observe the morphological changes and cell apoptosis of tumor tissue in each group.The changes of Fas and FasL protein expression in tumor tissues were analyzed by immunohistochemistry.The FasL and IFN-γ levels in peripheral blood were tested by the ELISA assay.ResultsICA exerted no obvious inhibitory effect on the proliferation of Eca-109 and TE-13 cell in vitro.The average volume and weight of xenografts tumor had statistical difference between the experimental group and the positive control group (P<0.05).The TUNEL staining results showed that the tumor tissues had obvious apoptosis,the number of apoptosis cells was significantly increased compared with the control group(P<0.05).The immunohistochemistry experimental results showed that the expression of Fas and FasL was significantly increased(P<0.05).The ELISA experimental results demonstrated that the FasL and IFN-γ levels of peripheral blood in the experimental group were significantly increased(P<0.05).ConclusionICA had no obvious inhibitory effect on esophageal cancer cell proliferation in vitro,but could induce in vivo apoptosis through the Fas expression and secretion of FasL and IFN-γ,thus plays the role of anti-esophageal cancer.

icariin;esophageal neoplasms;Fas-FasL;apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.008

河北省中医药管理局科研计划课题(2015124)。作者简介：纪昕(1980-)，主管检验师，硕士，主要从事临床生物化学和免疫学检验研究。△

，E-mail:lyjj221@sina.com。

R735.1

A

1671-8348(2016)12-1608-04

2015-11-18

2015-12-28)