T-SPOT.TB在结核性脑膜炎早期诊断中的价值

崔中锋　刘春礼　李　格　李　宁　张　莹　姜　瑜　李洋莹

郑州市第六人民医院　郑州　450000



T-SPOT.TB在结核性脑膜炎早期诊断中的价值

崔中锋刘春礼李格李宁张莹姜瑜李洋莹

郑州市第六人民医院郑州450000

目的探讨T-SPOT.TB在结核性脑膜炎早期诊断中的价值，为结核性脑膜炎的早期诊断提供有效检查方法。方法选择结核性脑膜炎40例(患者组)及非结核性脑膜炎感染 66 例(对照组)进行T-SPOT.TB检测，进一步比较多种检查方法诊断结核性脑膜炎的敏感性和特异性。结果脑脊液T-SPOT.TB实验显示，结核性脑膜炎组阳性检出率为95%(38/40)，非结核性颅内感染组为3.03%(2/66)；外周血T-SPOT.TB实验显示，结核性脑膜炎组阳性检出率为72.5%(29/40)，非结核性颅内感染组为13.64%(9/66)，均高于脑脊液抗酸染色涂片、结核菌培养、荧光定量PCR、结核抗体检测等方法，且具有较高的特异性。外周血T-SPOT.TB实验阳性检出率与脑脊液阳性检出率比较，差异无统计学意义(Fisher确切概率法，P=0.254)。结论运用T-SPOT.TB实验检测外周血和脑脊液单个核细胞结核杆菌感染的阳性率高于其他方法，明显提高了结核性脑膜炎的诊断率，采用T-SPOT.TB实验检测脑脊液诊断结核性脑膜炎阳性率高于外周血检测的阳性率。

结核性脑膜炎；脑脊液；T-SPOT.TB；

结核性脑膜炎是由结核分枝杆菌引起的脑膜和脊膜的非化脓性炎症性疾病，是中枢神经系统中最常见的一种严重威胁人类生命健康的疾病，同时也是病死率最高的肺外结核病。结核T细胞酶联免疫斑点实验是一种体外检测T淋巴细胞针对MTB特异抗原的γ干扰素(IFN-γ)分泌实验，为辅助诊断结核病的新技术[1-2]。本研究探讨T-SPOT.TB在结核性脑膜炎的早期诊断的价值。现分析如下。

1　资料与方法

1.1一般资料选择2014-06-2015-08在我院住院确诊并进行治疗的中枢神经系统感染性疾病患者：(1)结核性脑膜炎患者40例(患者组)，均符合结核性脑膜炎诊断标准[3]，均经抗结核治疗有好转或痊愈，男28例，女12例；平均年龄45.6岁。(2)非结核性颅内感染66例(对照组)，男36例，女30例；平均年龄48.3岁；其中新型隐球菌性脑膜炎4例，病毒性脑膜炎32例，化脓性脑膜炎30例。所有入选患者均同时无菌采集脑脊液和外周血标本。

1.2方法

1.2.1检测细胞工作液制备：所有患者的脑脊液均在医生的无菌操作下采集，把采集好的无菌脑脊液5～6mL打入含有肝素锂抗凝剂的试管内，并按照T-SPOT.TB的检测流程，在Ⅱ级生物安全柜内操作完成，并抽取含有肝素锂抗凝剂的外周静脉血4～6mL，加入4～6mL的淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心法收集单个核细胞层。将临床医生无菌操作下采集的脑脊液标本，用无血清培养液将脑脊液细胞密度调整到 0.1×106个/mL，外周血细胞标本浓度调整到为2.5×106个/mL的工作液待检。

1.2.2T-SPOT.TB检测：取细胞悬液100μL铺于预包被IFN-γ的PVDF板，每个样本均设测试孔A、测试孔B作为阴性对照，阳性对照4个孔。放入37 ℃的5%二氧化碳细胞培养箱培养16～18h，用冷去离子水裂解细胞，洗板后加入生物素标记抗体100μL/孔，培养箱中孵育1h，再次洗板，然后加入酶标亲和素在37 ℃的5%二氧化碳细胞培养箱孵育1h，洗板后加入AEC显色液，避光静置30min后去离子水终止显色，室温晾干后计数斑点。

1.2.3T-SPOT.TB检测结果判定：运用全自动读板仪计数斑点。阳性结果：①如果阴性对照孔斑点数为 0～5，用测试A和(或)测试孔B的斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6；②如果阴性对照孔斑点数≥6，测试孔A和(或)测试孔B的斑点数必须≥2倍阴性对照孔斑点数。脑脊液标本和用外周血调整好的工作液的结核抗体诊断方法均为进口免疫色谱层析法。

脑脊液标本和外周血涂片抗酸杆菌染色严格按照临床检验标准实验操作规程进行。脑脊液标本和外周血结核分支杆菌培养严格按照临床检验标准(SOP)实验操作规程进行。脑脊液标本和外周血的TB-DNA荧光定量PCR试剂由泰普生物科学有限公司提供，脑脊液TB-DNA(PCR)水平≥500copies/mL判定为阳性，<500copies/mL判定为阴性。

1.3统计学处理采用SPSS17.0软件进行数据分析，计数资料以百分率(%)表示，行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1不同方法对脑膜炎患者脑脊液标本检测结果T-SPOT.TB在40例结核性脑膜炎患者中检出阳性率为95%(38/40)，明显高于其他方法。见表 1。

表1　脑脊液不同方法对于不同患者的检测结果　(n，+/-)

2.2不同方法对外周血标本检测结果比较T-SPOT.TB在40例结核性脑膜炎患者中检出29例阳性，阳性率72.5%(29/40)。见表2。

表2　外周血运用T-SPOT.TB方法对于不同患者的检测结果比较　(n，+/-)

3　讨论

结核病是严重威胁人类生命健康的重要传染病之一，是导致死亡人数最高的单一传染病病种之一，全球约有2亿人死于结核病，新发结核病患者绝大多数在发展中国家，目前全球大约20亿的人口在受到结核杆菌的感染，每一年约有800万新发活动性结核病例，结核病在许多国家都已成为重大的公共卫生问题。目前，针对活动性结核的诊断与鉴别诊断仍面临巨大问题。我国是结核病高感染率的国家之一，现结核杆菌感染人数已超5亿，是全球22个结核病高负担国家之一，同时也是全球27个耐多药结核高流行国家之一；活动性肺结核病患者总数居于全球第2，仅次于印度，其中结核性脑膜炎约占6%左右[4]，临床表现多以凶险的Ⅱ期和Ⅲ期为多，且预后不良。结核性脑膜炎治疗的成功与否，很大程度上取决于，是否能够早期诊断和早期治疗。常规的实验室诊断方法中，结核菌素实验诊断肺外结核分枝杆菌感染的灵敏度与特异度仅为 67.57% 和 56.67%[5]，脑脊液涂片镜检阳性率则更低。结核分枝杆菌的培养法比涂片镜检法阳性率较高约为60%，但由于结核分枝杆菌生长比较缓慢，大约每18h分裂1次，所以结核分枝杆菌培养方法检测时间相对长(需1个半月)，而且自动化设备器械较贵，很难在常规实验室大量开展。近年常用的PCR检测方法，依赖于成功获得含有结核杆菌的患者标本，如果标本中不含结核菌或含量太低，检测结果则呈阴性。另外PCR检测容易污染而造成假阳性率较高，很难实现精准、快速的结核病早期诊断。T-SPOT.TB检测方法作为一种新的酶联免疫检测方法，是目前免疫学方法检测结核病比较成熟的检测技术，在国外已开始应用于结核杆菌感染的检测。因为T-SPOT.TB是从单个细胞水平检测，因而可及时捕获细胞周围分泌的细胞因子，故该方法的灵敏度高，特异性强，操作简单，耗时少，可快速出结果。本方法通过检测IFN-γ来诊断是否存在结核杆菌感染，而不会同卡介苗和环境中的分枝杆菌发生交叉免疫反应，同时也不受机体免疫状况的影响，其假阳性率和假阴性率显著低于结核菌素试验(TsT)。

综上所述，T-SPOT.TB检测对结核性脑膜炎诊断的灵敏度在脑脊液标本中达到95%，在外周血标本中达到72.5%，明显高于其他几种常规检测方法。且外周血标本采集方便，是结核性脑膜炎的重要辅助诊断方法，在依靠临床表现和原有相关常规检查检测的基础上增加T-SPOT.TB检测，进一步综合判断，可提高诊断准确性，减少漏诊率，对于结核性脑膜炎患者的早期诊断及早期治疗具有积极意义。

[1]LalvaniA，PathanAA，MeShaneH，etal.RepiddetectionofMy-cobacteriumtuberculosisinfectionbyenumerationofantigen-specif-icTcells[J].AMJRespirCritCareMed，2001，163(4)：824-828

[2]陆建红，陈国军，杜开齐，等.结核T细胞酶联免疫斑点实验诊断结核感染的临床应用[J].武警医学，2013，24(10)：866-868.

[3]DignanFL，EvansSO，EthellME，etal.AnearlyCT-diagnosis-basedtreatmentstrategyforinvasivefungalinfectioninallogeneictransplantrecipientsusingcaspofunginfirstline：aneffectivestrategywithlowmortality[J].BoneMarrowTransplant，2009，44(1)：51-56.

[4]全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组.2010 年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志，2012，34(8)：485-508.

[5]陆建红，陈国军，杜开齐，等.结核T细胞酶联免疫斑点实验快速诊断肺外结核感染的应用价值[J].中国综合临床，2014，30(9)：945-948.

(收稿2015-12-14)

R743.33

B

1673-5110(2016)16-0097-02