毁灭炭疽菌诱抗蛋白的分离纯化及对烟草抗病促生作用

田 华，陈光勇，董 瑜，王 静，王贻鸿，孔凡玉*

（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.云南省曲靖市烟草公司会泽分公司，云南 会泽 654200）

毁灭炭疽菌诱抗蛋白的分离纯化及对烟草抗病促生作用

田 华1，2，陈光勇3，董 瑜3，王 静1，王贻鸿1，2，孔凡玉1*

（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.云南省曲靖市烟草公司会泽分公司，云南 会泽 654200）

为明确诱抗蛋白能够对烟草产生抗病促生作用，采用加热、离心、硫酸铵分级沉淀、透析和凝胶色谱柱等方法，从毁灭炭疽菌（Colletotrichum destructivum）中分离纯化出一种诱抗蛋白，并采用喷雾接种和摩擦接种的方法研究其预防保护作用。结果表明，经SDS-PAGE显示该诱抗蛋白分子量约为38 kD，且目的蛋白存在于Pro-P2-TX组份中；对烟株进行烟草普通花叶病毒病的接种试验，接种 3 d后，诱抗蛋白处理组烟草叶片枯斑数明显少于清水对照组，对 TMV的诱抗效果为73.79%；该诱抗蛋白能够明显促进烟草的生长，诱导处理40 d后，烟草的株高、叶宽和茎围与清水对照相比明显增加，其中株高增长72.43%，叶宽和茎围分别增加61.06%和29.05%。因此，试验结果说明毁灭炭疽菌诱抗蛋白具有诱导烟草产生抗病性和促进烟草生长的作用。

诱抗蛋白；毁灭炭疽菌；分离纯化；诱导抗病性；烟草生长

烟草普通花叶病毒病由烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）引起，在世界各个烟区普遍发生，是造成烟草产量损失的重要因子之一。此病自苗床至大田整个生育期均可连续发生，传播途经简单，危害面广［1-2］，经济损失大，目前防治该病主要应用化学药剂，但是过多依赖化学药剂会导致病原物产生抗药性及环境污染［3］，所以生物防治逐渐成为防治植物病害的研究热点。生物农药产品无毒，不引起病虫害的抗药性，在植物体和土壤中易分解，无残留，可大幅度提高烟草质量和国际竞争力。目前有许多生物抗病毒剂已经投入到烟草生产的实用阶段，但是预防和防治效果并不显著，因此研究和开发有效的抗病毒病生物制剂是烟草生产上亟待解决的问题［4］。

激发子是一类能够诱导寄主或非寄主植物产生防卫反应的特殊化合物［5-6］，依据生物化学结构，生物源激发子主要有寡糖和蛋白质两种类型［7］。近年来，利用蛋白质类激发子控制植物病害的研究愈来愈受到重视。2001年美国Eden生物公司成功将梨火疫病原细菌（Erwinia amylovra）中的一种蛋白质开发为抗病生防农药Messenger［8］，被称为作物生产和食品安全的一次绿色革命。国内学者已经从交链孢菌（Alternaria spp.）、镰刀菌（Fusarium spp.）等多种真菌中分离出一类蛋白质激发子［9］，虽然来源不同，但都可以诱导植株产生抗病性，并能促进植株生长、改善品质以及增加产量。其中邱德文用稻瘟菌蛋白质激发子处理烟草普通花叶病毒病，其控制效果在75%以上［10］。李杰等［11］研究发现，极细链格孢菌66 kD诱抗蛋白可以诱导烟草抗TMV，枯斑抑制率可达 49%。用激活蛋白制剂处理烟株，能显著促进烟草生长，使烟草株高、叶面积和留叶数都显著增加，并能明显改善烤烟品质［10］。卜冰武等［12］研究发现，大丽轮枝菌蛋白质激发子能够诱导棉花抗黄萎病，病害减轻率达35.04%。

根据前人的研究，本试验从毁灭炭疽菌（Colletotrichum destructivum）中分离纯化出一种38 kD的诱抗蛋白，观察其对TMV的诱抗效果以及对烟草的促生作用，为以后的田间防治应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1供试材料

供试植株及菌株：烟草品种是小黄金 1025，TMV普通株系（TMV-U1）毒源以及枯斑寄主材料是三生烟（Nicotiana tabacum var. samsun NN），由中国农业科学院烟草研究所提供；毁灭炭疽菌由本实验室4 ℃保存备用。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL（PDA液体培养不加琼脂）。

1.2试验方法

1.2.1毁灭炭疽菌菌丝的培养 将保存的毁灭炭疽菌菌种接种于 PDA培养基活化后，用打孔器分别打取直径为5 mm的3个菌饼接种于PDA液体培养基中，28 ℃，180 r/min恒温振荡培养3 d。真空抽滤收集菌丝体，抽滤过程中用双蒸水洗涤4次，冻存于-20 ℃冰箱保存备用［13］。

1.2.2毁灭炭疽菌诱抗蛋白的粗提 将冻存的菌丝体用液氮研磨为粉状，加入到 30 mmol/L的HEPES缓冲液（pH 7.1）中，缓冲液的体积为PDA培养基的十分之一，混合后沸水浴 30 min，4 ℃，13 000 r/min离心20 min，收集上清液。在上清液中加入0.1%的活性碳和0.1%的鱼精蛋白［14］置于冰盒中缓慢搅拌10 min，然后4 ℃，13 000 r/min离心20 min，收集上清。将收集的上清进行30%的硫酸铵沉淀，4 ℃，13 000 r/min离心30 min，收集上清弃沉淀。再将上清进行 70%的硫酸铵沉淀，4 ℃，13 000 r/min离心30 min，收集沉淀，再次溶解于HEPES缓冲液中，4 ℃条件下透析2 d，冷冻干燥，获得毁灭炭疽菌粗蛋白，并采用SDS-PAGE电泳检测蛋白分子量。

1.2.3毁灭炭疽菌诱抗粗蛋白的纯化 Sephacryl S200凝胶色谱柱分离纯化：根据蛋白混合物中各组分的分子量分布，选用Sephacryl S200（分离范围5-250 kD）凝胶色谱柱对其进行分离纯化。首先对蛋白液进行离心，上清冷冻干燥。干燥后样品用于Sephacryl S200凝胶渗透柱层析。取蛋白样品适量，用流动相溶解后过0.22 µm滤膜备用，按下列色谱条件进行纯化：Sephacryl S200凝胶渗透色谱柱（2.6×100 cm，柱体积500 mL）；流动相：磷酸盐缓冲液（含100 mmol/L NaCl，pH 7.4）；流速：0.5 mL/min；柱温：室温；紫外检测波长：280 nm。合并收集各洗脱组分，离心浓缩，上清冷冻干燥。

采用Sephacryl S200凝胶渗透色谱获得的组份，为了减少上样体积，对其进行浓缩。浓缩后每个组份洗出大量的盐，上清部分通过Sephadex G10进行脱盐，盐析部分透析除盐。

Sephadex G10凝胶色谱柱除盐：将 Sephacryl S200凝胶渗透色谱获得组份的上清液过0.22 µm滤膜备用，各个组分3次上样，每次上样约2 mL。色谱条件：Sephadex G10凝胶渗透色谱柱（1.6×100 mm，柱体积 180 mL）；流动相：H2O；流速：0.6 mL/min；柱温：室温；紫外检测波长：280 nm；每管收集4 mL。合并收集各组分，调节磷酸盐缓冲液至终浓度为 20 mmol/L，冷冻干燥后于-50 ℃冰柜中保存。

透析除盐：将浓缩液析出的盐部分透析，以 5 mmol/L PBS为透析外液，透析袋截留量为1 000 Da，透析至透析外液电导值不再变化，透析内液分装冻干，并将各个组分分管冷冻干燥后于-50 ℃冰柜中保存。

纯化组分的SDS-PAGE检测：每个组份各取一管冻干样品，加入200 µL水溶解，取20 µL溶液加入5 µL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×），100 ℃，3 min。然后进行SDS-PAGE检测。

1.2.4诱抗蛋白对TMV的诱抗效果 采用BCA[15]蛋白定量分析试剂盒将蛋白液浓度稀释为6 mg/mL。当三生烟长至6~8片时，用纯化后浓度为6 mg/mL的诱抗蛋白进行整株喷雾处理，叶面均匀挂满雾滴不流淌即可，以喷施等量HEPES缓冲液和清水做为对照。诱导处理3 d后，采用常规的摩擦接种和半叶法[16]接种病毒，用消毒棉棒蘸取少量病毒汁液，轻轻摩擦叶片，仅使叶片表皮细胞造成微伤口，每株接种 3片展开叶。接种后喷清水冲洗残留汁液，25 ℃培养，3 d后调查枯斑数，并计算诱抗效果。每个处理5株，共3次重复。诱抗效果=（清水对照枯斑数-处理枯斑数）/清水对照枯斑数×100%

1.2.5诱抗蛋白对烟草的促生作用 采用 BCA[15]蛋白定量分析试剂盒将蛋白液浓度稀释为6 mg/mL。当小黄金烟草长至6~8片时，每隔7 d用6 mg/mL的诱抗蛋白进行整株喷雾处理，叶面均匀挂满雾滴不流淌即可，以喷施等量HEPES缓冲液和清水做为对照。40 d后，定株调查株高、叶宽和茎围。设3次重复，每处理共90株。

1.3数据分析

试验数据采用Microsoft excel 2003和DPS 13.0软件进行统计分析，并采用Duncan新复极差法进行差异显著性检验。

2　结　果

2.1毁灭炭疽菌诱抗蛋白的粗提

毁灭炭疽菌菌丝经过加热、离心、硫酸铵分级沉淀和冷冻干燥后，分离提取获得诱抗粗蛋白，经SDS-PAGE电泳检测显示诱抗粗蛋白分子量大小约为38 kD（图1）。

图1　诱抗粗蛋白SDS-PAGE电泳图（1、2、3：诱抗蛋白，M：低分子量标准蛋白）Fig. 1 Crude protein in SDS-PAGE（1, 2, 3: protein elicitor, M: marker）

2.2毁灭炭疽菌诱抗粗蛋白的纯化

Sephacryl S200凝胶色谱柱分离纯化：按上述色谱条件进行纯化后，其色谱图如图2所示。从图中可以看出，在洗脱体积400 mL之前，4次洗脱重现性较好，但在洗脱体积450 mL左右每次洗脱色谱图均有所差别，但大体趋势类似。按峰收集了4个组分，分别命名为Pro-P1 TX、Pro-P2 TX 、Pro-P3 TX、Pro-P4 TX。合并收集后，每个组分旋转蒸发浓缩，等待冻干后通过Sephadex G10色谱柱脱盐。

图2　蛋白样品的Sephacryl S200分离图（上样4次）Fig. 2 Sephacryl S200 separation of the protein elicitor

Sephadex G10凝胶色谱柱除盐：将Pro-P1、Pro-P2、Pro-P3和Pro-P4进行Sephadex G10脱盐处理 ，每个组分3次上样的重现性良好，蛋白样品与盐可以很好的分离。收取60～75 mL处浓缩后的洗脱液，加入 100 mmol/L的 PBS缓冲液至终浓度为 20 mmol/L，冷冻干燥后于-50 ℃柜中保存。

SDS-PAGE：各个组份加水溶解后，其中 Pro-P1 TX和Pro-P2 TX相当于浓缩10倍，Pro-P3 TX 和 Pro-P4 TX相当于浓缩 15倍。结果显示，Pro-P1～P4 TX样品经电泳可以看到微弱的电泳条带，且从P1到P4电泳迁移率增大，表明从P1到P4，蛋白的分子量降低；其中在Pro-P2 TX（lane 2）中发现了目的蛋白条带，其他组分中未发现；目的蛋白在浓缩时出现盐析现象，并存在于浓缩后的沉淀中；经追踪检测，目的蛋白存在于Pro-P2-TX组分中（图3）。

图3　蛋白样品SDS-PAGE图（1~4: Pro-P1~P4 TX; M: 低分子量标准蛋白）Fig. 3 Purification of the protein in SDS-PAGE (1~4: Pro-P1~P4 TX; M: Marker )

2.3诱抗蛋白对TMV的诱抗效果

纯化后的诱抗蛋白对TMV有一定的诱抗作用，TMV采用半叶法接种3 d后，可以观察到，诱抗蛋白处理组的枯斑数明显少于HEPES缓冲液和清水对照组的枯斑数（表1）。诱抗蛋白液处理组枯斑数平均每半叶为10.22个，清水和HEPES缓冲液对照组枯斑数为39.00和34.78，差异显著，而HEPES缓冲液与清水处理的烟株枯斑数无显著差异，诱抗蛋白对TMV的诱抗效果为73.79%，说明诱抗蛋白对TMV有一定的预防保护作用。

表1　诱抗蛋白对TMV的诱抗效果Table 1 Anti-tobacco TMV activity induced by the protein elicitor

2.4诱抗蛋白对烟草的促生作用

纯化后的诱抗蛋白能够明显促进烟草的生长，表现为株高、叶宽和茎围的增加。诱抗蛋白诱导处理40 d后，与清水对照相比，诱抗蛋白处理组烟草株高约为17.14 cm，增长72.43%，叶宽约为10.11 cm，增长61.06%，茎围约为0.63 cm，增长29.50%，且差异显著（表2）。

表2　诱抗蛋白对烟草的促生作用 cmTable 2 Facilitating the growth of tobacco induced by the protein elicitor cm

3　讨　论

毁灭炭疽菌诱抗蛋白是本研究小组从毁灭炭疽菌中分离纯化出的一种蛋白质类激发子。由于诱抗蛋白是一类耐热性的蛋白质类激发子，因此在分离提取的过程中，本研究小组采取了加热离心的方法，首先去除其中大部分的非耐热性杂蛋白质。由于诱抗蛋白的分子量较小，一般为30~70 kDa[9]，所以利用30%硫酸铵分级沉淀的方法，可以去除掉一些大分子的蛋白质。整个分离提取过程要在4 ℃低温条件下进行，以有效抑制蛋白酶对粗蛋白组分的分解作用。色素有紫外吸收作用，核酸可以扰乱蛋白溶液pH值，所以本试验通过加入活性炭和鱼精蛋白［13］的方法，离心沉淀去除了大部分的色素和核酸物质，所有这些分离提取技术为后续的蛋白纯化鉴定了一定的基础。SDS-PAGE是一种常用的电泳技术，经常应用于提纯过程中纯度的检测，其具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况［17］。所以本实验室采用SDS-PAGE技术对分离纯化得到的蛋白组分进行检测，得到目的蛋白存在于Pro-P2-TX组分中，分子量大小约为38 kDa。

TMV是烟草整个生育期比较严重的病害，本研究小组用分离纯化后的诱抗蛋白处理烟草植株，使烟草植株产生诱导抗病性，其诱抗效果为73.79%，说明该诱抗蛋白可以有效的预防TMV的发生。目前提高烟叶的生产质量与产量，增加烟农的收入，成为整个烟草烟草行业亟待解决的问题，本试验研究发现，经该诱抗蛋白处理后，烟草植株的株高、叶宽和茎围较对照有明显的增加。诱抗蛋白作为一种生物防治方法，不存在化学农药的弊端，比如抗药性和食品安全等问题。为了更广泛的利用诱抗蛋白，本实验室还需要进一步的研究诱抗蛋白对烟草其他病虫害以及对不同品种植物的诱抗作用，同时需要增加田间的试验，以期为病害生物防治提高更有效的方法。

前人研究发现真菌源蛋白质类激发子可以通过不同的代谢途径实现信号传导，引起基因表达，激活植物自身防御系统和生长系统，促进植物生长，提高作物产量和产品品质［18］。袁肖寒研究发现，经诱抗蛋白处理后，水稻过氧化物酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性及过氧化氢含量有了显著变化［19］。PR-1a、PR-1b和NPR1基因都是病程相关蛋白基因，基因 PR-1常作为植物系统抗性的重要特征以及水杨酸信号传导（Salicylic acid，SA）途径的标记基因［20］，NPR1是植物系统获得抗性（Systemic acquired resistance， SAR）信号途径中的一个关键的调控因子［21］。所以本研究小组在以后的试验中，应该对该诱抗蛋白的作用机理进行探索，包括相关防御酶的活性变化，相关抗性基因的表达以及诱抗蛋白信号传导途径中的关键作用因子等，为该诱抗蛋白真正广泛应用于病害防治，并开发成一种新型的生物农药打下良好的基础。

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Purification of a Protein Elicitor from Colletotrichum destructivum and Its Biological Activity in Inducing Tobacco Resistance and Facilitating Growth

TIAN Hua1，2， CHEN Guangyong3， DONG Yu3， WANG Jing1， WANG Yihong1，2， KONG Fanyu1*
（1.Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China； 2.Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China， 3. Huize Branch of Qujing， Yunnan Province Tobacco Company， Huize，Yunnan 654200， China）

To functionally investigate the mechanisms of disease resistance and tobacco growth， we have isolated a protein elicitor from mycelium of Colletotrichum destructivum by heating， centrifugation， precipitation， dialysis and gel chromatography column. We then measured the prevention and protection effects of this protein using spray and friction inoculation methods. The results showed that the protein elicitor appeared in Pro-P2-TX and the molecular weight was approximately 38 kD on silver-stained SDS- PAGE. The inhibitory effect to tobacco mosaic virus （TMV） was 73.79%. The protein elicitor could remarkably increase the individual plant height by 72.43%， leaf width by 61.06% and stem circumference by 29.05% respectively. Taken together， the protein elicitor has the role of inducing tobacco resistance and facilitating growth.

protein elicitor； Colletotrichum destructivum； inductive resistance； isolation and purification； tobacco growth

S435.72

1007-5119（2016）04-0068-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.012

福建省烟草公司南平市公司科技项目“烟草根茎病害系统控制技术”（201203）

田 华，女，在读硕士，研究方向为烟草病害防治。E-mail：376609425@qq.com。*通信作者，E-mail：kongfanyu123@163.com

2016-02-24

2016-04-12