促性腺激素抑制激素—抑制素—卵泡抑制素融合基因疫苗的构建

王天翔，李范文，刘继刚，王喜军，王丽娟，吕会芹，王洮生

(甘肃省绵羊繁育技术推广站，甘肃 张掖 734000)



促性腺激素抑制激素—抑制素—卵泡抑制素融合基因疫苗的构建

王天翔，李范文，刘继刚，王喜军，王丽娟，吕会芹，王洮生

(甘肃省绵羊繁育技术推广站，甘肃 张掖 734000)

促性腺激素抑制激素(GnIH)是唯一被阐明对GnRH、LH起着负调控作用的神经肽，在非繁殖期抑制动物的繁殖功能，为运用生殖免疫原理中和GnIH，调节GnRH、LH激素水平，诱导藏羊非繁殖季节发情提供契机。本研究以GnIN-INH-Follistatin-(C3d)融合的PET28a-GnIN-INH-Follistatin-(C3d3)原核表达载体为基础，将GnIN-INH-Follistatin-C(3d3)转入真核疫苗表达载体pSEC-tag2a中构建pSEC-tag2a -GnIN-INH-Follistatin-C(3d3)基因疫苗。将质粒转染HEK293细胞，转染24 h后收集细胞，做采用takara的荧光定量PCR 用2X premix 对基因进行RT-PCR试验来验证，表明pSEC-tag2a-GnIN-INH-Follistatin-C3d3质粒转染HEK293细胞后能够在HEK293细胞内稳定表达。结果表明，成功构建INH-GnIH融合基因疫苗，为开展研究免疫后非繁殖季节藏羊生殖激素表达规律工作提供理论和技术支撑。

促性腺激素抑制激素；抑制素；基因疫苗

生殖激素免疫中和技术就是以生殖激素为抗原主动或被动免疫动物之后可以中和动物体内相应激素，使其生物活性部分或全部丧失，从而引起生殖内分泌的动态平衡系统发生定向移动，进而产生了所预期的生理变化情况。应用生殖激素免疫中和激素不仅可以研究激素的生理功能，而且还可开发动物繁殖新技术。目前应用生殖激素免疫中和技术已开发出的TIT双羔素疫苗(抗原：睾酮-3-羧甲基肟-牛血清白蛋白)、抑制素DNA疫苗以及中和GnRH用于动物去势、避孕、终止妊娠的GnRH疫苗。在生殖激素免疫中和技术的研究过程中，生殖激素抗原的来源主要是通过性腺组织物提取、化学合成、基因工程重组技术制备，但因其来源有限、成本高，限制了生殖激素免疫中和技术在家畜生产中的应用。随着分子生物学在生殖激素抗原制备领域的研究和应用，基因疫苗的诞生和发展，为生殖激素免疫中和技术研究提供了新的契机。基因疫苗就是将编码抗原的核酸序列组装到含有必要表达调控元件的真核表达载体中构建基因疫苗，然后直接接种到动物机体中，重组的基因疫苗可以利用宿主体内的酶系合成外源基因编码的蛋白，诱导宿主机体对该外源蛋白产生特异性的免疫应答，从而达到免疫的目的。基因疫苗技术与其他生殖激素抗原合成技术相比具有良好的免疫效果、由于其具有安全性较高、持久性、同种异株的交叉免疫保护作用，同时它的制备较简便、成本比较低廉，且由于其便于贮藏和运输等许多方面具有潜在优势。近几十年来，应用基因免疫技术构建了含有分泌型信号肽-狗胰岛素前原信号肽(Dog pre-pro-insulin signal sequence, DPPISS)、分子佐剂绵羊补体C3d(Sheep complement factor 3d, sC3d)的抑制素基因疫苗-“sC3d3-抑制素”(INH)真核融合表达分泌型质粒(pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3)，用此质粒免疫大鼠、绵羊之后可以可促进 FSH、E2分泌，从进而促进卵泡发育。然而INH基因疫苗的免疫效果在大、小动物之间存在差异，推测与生理代偿作用有关，且抑制素基因疫苗仅能在繁殖季节免疫，对INH基因疫苗在季节性繁殖动物中的应用起到了限制性作用。

促性腺激素抑制激素(GnIH)是唯一被阐明对GnRH、LH起着负调控作用的神经肽，在非繁殖期抑制动物的繁殖功能，为运用生殖免疫原理中和GnIH，调节GnRH、LH激素水平，诱导藏羊非繁殖季节发情提供契机。基于前期研制的INH基因疫苗系统构建GnIH-INH融合基因疫苗，为应用生殖免疫技术中和体内INH、GnIH，使其生物活性部分或全部丧失，研究正常生理、GnIH基因免疫条件下非繁殖季节藏羊发情周期中发情行为、卵泡发育、生殖激素水平的变化，明确内分泌调控机制提供技术支撑。

1　材料与方法

1.1材料

Psec-tag2a和pET28a -3(C3d)、pET28a-GnIH-INH-Follistatin质粒由畜牧实验室提供。DNA凝胶回收试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司；LA Tap ligase购于宝生物工程(大连)有限公司；T4 DNA ligase购于宝生物工程(大连)有限公司；Xho I 购于宝生物工程(大连)有限公司；EcoR I购于宝生物工程(大连)有限公司；IPTG购于美国Sigma Aldrich公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购于天跟生化科技(北京)有限公司；PVDF膜购于索莱宝生物科技(北京)有限公司；Rabbit Anti-sheep serum albumin购于美国Abcam公司；蛋白分子量marker和预染marker购于美国Bio-rap公司；GnIH基因购于上海强耀生物有限公司；DAB显色液购于中杉金桥生物技术(北京)有限公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1引物根据GenBank中的GnIH-INH-Follistatin的核苷酸序列和Psec-tag2a载体序列，用Primer Primer 5.0和Lasergene软件设计一对引物，并送至生工生物工程(上海)有限公司进行合成，采用PAGE纯化。

表1　GnIH-INH-Follistatin与INH的PCR引物

1.2.2构建重组表达载体Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistatin-3(C3d) 将测序正确的Psec-tag2a和pET28a-3(C3d)、pET28a-GnIH-INH-Follistatin质粒分别用BamHI和XhoI双酶切，然后进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收相应片段。以胶回收产物做为模板，并采用10X PCR Buffer 2.5μl、ExTaq(Takara)0.25 μL、dNTP(2.5 mM)1 μL、F (10 μM) 0.5 μL、R (10 μM) 0.5 μL和Template 0.5 μL配制PCR反应液。反应的总体积为25 μL，混合均匀后放于PCR反应仪中。条件为预变性94 ℃ 5 min、变性94 ℃ 30 s、退火63 ℃30 s、延伸72 ℃ 1 min、循环35个、延伸 72 ℃ 10 min。将回收的PCR产物与与表达载体Psec-tag2a用T4连接酶进行连接后，转化、挑单克隆进行测序、酶切鉴定。按照上述酶切、连接、转化程序分别构建重组质粒Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistatin、Psec-tag2a-3(C3d)、Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistatin -3(C3d)载体。

1.2.3质粒Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistatin-3(C3d)转染试验将提取的Psec-tag2a-GnIH-INH- Follistatin-3(C3d)质粒质粒转染到hek293细胞，转染24 h后收集细胞，采用takara的荧光定量PCR 用2 X premix 对基因进行RT-PCR试验来验证基因的表达情况。

2　结果与分析

2.1Psec-tag2a、Psec-tag2a-3(C3d)质粒电泳图

以DL-5000为Marker 进行1%琼脂糖凝胶电泳，从图1中可以看出Psec-tag2a、Psec-tag2a -3(C3d)质粒大小与预期相同(分别在3 000 kb、5 000 kb左右)。

图1　 Psec-tag2a、Psec-tag2a -3(C3d)电泳图

M：5000bp DNA Ladder；1 Psec-tag2a质粒；2,3,4 Psec-tag2a-3(C3d)质粒

图2　 Psec-tag2a-3(C3d)双酶切

M: 5000bp DNA Ladder；1,2,3 Xho I+BamH I双酶切Psec-tag2a-3(C3d)

2.2Psec-tag2a-3(C3d)质粒双酶切

Psec-tag2a -3(C3d)经Xhol /BamH I双酶切后，以DL-5000 Marker进行 1%琼脂糖凝胶电泳，结果呈现出与预期结果(3000bp )相符的条带(图2)。

2.3GnIH、INH融合基因的PCR扩增

以GnIH的基因为模板，扩增GnIH的基因的DNA片段，经1%的琼脂糖凝胶电泳(见图3)，扩增出的片段为417bp，与预期相同。

2.4Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistatin-3(C3d)质粒的PCR鉴定

采用普通taq酶对Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistatin-3(C3d)质粒进行PCR鉴定，其结果如图4。

图3 　GNIH基因的PCR扩增

M: 2000bp DNA Ladder；1,2 GnIH基因的PCR产物

图4　 Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistatin-3(C3d)的PCR扩增

M: 2000bp DNA Ladder；1,2,3 Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistatin-3(C3d)的PCR产物

2.5Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistatin-3(C3d)质粒转染

提取Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistatin-3(C3d)质粒，将质粒转染hek293细胞，转染24 h之后收集细胞，并采用takara的荧光定量PCR用2X premix对基因进行RT-PCR试验来验证基因的表达情况，其结果如图5。

图5　 GnIH-INH基因的转染

1.Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistatin-3

(c3d)转染组；2.对照组；M、Marker：2000

3　讨论

在羊的发情周期中的排卵阶段，GnIH的表达基因非常低，而在非发情季节GnIH产量和分泌到垂体门户血液中的GnIH则非常高。到目前为止，关于GnIH神经元细胞的的调节机制知之甚少。尽管在啮齿动物中只有一小部分与GnIH神经元表达相关的受体，但这些研究数据表明GnIH受到雌激素的调节。在小鼠体内19%的细胞表达雌激素受体(ER)-a但并没有表达ER-b。在切除卵巢的雌性小鼠体内连续4天注射雌二醇，然后采用原位杂交技术检测，检测到在GnIH细胞中雌二醇的受体的数量非常少。在绵羊中，22%的细胞表达ER-a，60%的细胞表达ER-b，后者是一个值得关注结果以及GnIH通过ER-b的调节功能应该被研究。总之，在细胞水平关于性甾体调节GnRH功能的影响只有有限的数据，最有可能的是这些表达相关受体的影响是通过中间神经元传递的。在雄性动物中关于GnIH神经元的调节的数据非常的少，在对雄性叙利亚仓鼠的研究中睾酮对GnIH的表达没有影响。在羊和仓鼠中，季节性变化以及季节性变化的调节机制对GnIH细胞的影响是一个非常热的研究领域。羊在长日照的乏情期，GnRH细胞数量减少的趋势符合他们的生殖状态。GnIH 是近年发现的一种RF酰胺神经肽, 具有抑制促性腺激素合成和分泌的作用, 还有促进禽类摄食的作用。根据上述情况在藏羊方面，本试验利用其有可能对生殖激素的作用来提高其繁殖率进行本研究，以达到为畜牧生产和社会经济建设服务的目的。

C3d的被发现能很好地提高与之相连抗原的免疫原性以来，同时C3d在作为分子佐剂方面的研究已经取得了很大进展，近年来人们对C3d的研究越来越重视对。C3d是补体C3酶解的最小片段，已经不能再被分解， C3d可以促进抗原递呈细胞对抗原的摄取、递呈，促进免疫应答格局的转变、调节免疫应答等等方面起到连接固有性免疫和特异性免疫桥梁的作用。利用Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistatin-3(C3d)的构建间接地证明了GnIH与INH基因在真核细胞中的表达，同时也间接地证明了证明C3d可以在核酸疫苗方面可以起到分子佐剂作用。

本试验所选用Psec-tag2a作为表达载体，Psec-tag2a具有多拷贝、强启动、操作方便等优点，在体外进行体外细胞转染时，Psec-tag2a的效率比较高，最为重要的是Psec-tag2a携带有小鼠 Igk 链V_T2_C区域的分泌信号，这是专门为重组蛋白的高效性分泌而进行设计的，这就使其适合于多种细胞系中进行表达同时分泌融合蛋白的真核质粒这一优点，这有可能带动多克隆位点的GnIH-INH基因表达产物到胞外，并从而可以增强免疫应答的效果。结果表明，真核分泌表达质粒Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistatin-3(C3d)构建成功，转染hek293细胞后，在细胞培养上清液中检测出GnIH-INH蛋白的表达，这将为Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistatin-3(C3d)基因疫苗免疫效果的下一步的研究奠定了基础。试验中的抗原表位选用的是牛的GnIH主要原因有三种，一是若选用羊的GnIH抗原表位有可能导致免疫抑制而使免疫失去活性;二是选用的牛的GnIH包含了羊的一段GnIH表位基因，既避免了免疫抑制的影响，又为今后在其他动物上的研究奠定基础;三是羊的GnIH表位基因太短表达的抗体难以检测。

4　结论

本试验成功地构建了Psec-tag2a-GnIH-INH-Follistati-3(C3d)真核表达质粒，采用RT-PCR转染细胞对其表达情况进行了研究并证实了表达产物的活性，为下一步Psec-tag2a-GnIH- INH-Follistati -3(C3d)质粒用于研究对生殖激素的影响奠定了基础。

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Construction of the Gonadotropin Inhibiting Hormone-Inhibiting Hormone-Follicostatin Fusion Gene Vaccine

WANG Tian-xiang, LI Fan-wen,LIU Ji-gang, WANG Xi-jun,WANG Li-juan, LV Hui-qin, WANG Tao-sheng

(GansuProvincialSheepBreedingTechnologyExtensionStation,ZhangyeGansu734031China)

Gonadotropin inhibiting hormone is the only elucidated neuropeptide that plays a negative regulatory role on gonadotropin-releasing hormone and luteotropic hormone. As a result, it can inhibit animal reproduction function during non-breeding period. This study provide an opportunity for inducing the Tibetan estrus at anestrous season by reproductive immune principle to neutralization gonadotropin inhibiting hormone,adjusting the gonadotropin-releasing hormone and luteotropic hormone. With the GnIH-INH-Follistatin fusion of pET28a-GnIH-INH- Follistatin -3(C3d) prokaryotic expression vector as the foundation, then GnIH-INH-Follistatin- 3(Cd3) was transferred into eukaryotic expression vector vaccine pSEC-tag2a to build the vaccineof pSEC- tag2a-GnIH-INH-Follistatin-3(Cd3) gene.With the transfectionof plasmid to HEK293 cells, after 24 hours, collecting cells, then doing the takara fluorescence quantitative PCR in 2X premix for gene RT-PCR test to verify.The results showed that pSEC-tag2a-GnIH-INH- Follistatin-C3d3 plasmid can be stably expressed in HEK293 cells after transfection. The results revealed that the INH-GnIH fusion gene vaccine was established,which lay a foundation for the multipleting immunization work in the non-breeding season.

GnIH; INH; gene vaccine

2016-05-30

国家绒毛用羊产业技术体系(CARS-40-33)。

王天翔(1968-)，男，甘肃通渭人，本科，高级畜牧师，主要从事细毛羊育种和绵羊繁育技术推广工作。

S 859.79+6

A

1004-6704(2016)05-0009-04