两种药物诱导小鼠高血糖模型在降糖实验中的运用比较与问题探讨

首都医科大学医学实验与测试中心（100069）曹丽歌 蒋雪云 田蜜 高丽芳 罗葵 崔淑香

目前常用的糖尿病动物模型可分为自发性、实验性和转基因模型三种。国外多采用自发倾向的糖尿病近交系纯种动物制作模型，如BB（Bio Breeding）鼠，DB（Diabetes）鼠和NOD（Non-Obestiy Diabetes）鼠[1]。国内一般是使用化学药物选择性地破坏胰岛细胞，形成急性糖尿病模型，最常用的药物是链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）和四氧嘧啶（Alloxan, ALX）。本文结合国家食品药品监督管理局（SFDA）颁布保健食品辅助降血糖功能评价方法[2]，分别采用STZ和ALX腹腔注射诱导小鼠高血糖模型，通过比较两者在降血糖实验中的效果差异，探讨建模和血糖测定的最佳方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康ICR雄性小鼠（6周龄），体重为24±2g，由维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2012－0001。动物饲养场所由首都医科大学实验动物部提供，合格证号：SYXK（京）2010－0020，室内温度（22±2）℃，相对湿度（50±20）%。喂饲真空包装无菌饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2014-0010。

1.2 主要仪器和试剂

1.2.1 仪器，ACCU-AHEK卓越型血糖仪（罗氏公司生产）。

1.2.2 试剂 STZ和ALX（Sigma公司生产）；注射用生理盐水（山东华鲁制药有限公司生产）；葡萄糖（北京现代东方精细化学品有限公司生产）；干预用保健食品地黄玉片（由某科技有限公司提供）；血糖试纸（罗氏公司生产）。

附表1 两种药物诱导小鼠高血糖模型体重变化（x±s，n=10）

附表2 两种药物造模结果的比较（x±s，n=10）

附表3 糖耐量实验血糖仪测定出现HI值情况（n=10）

附表4 糖耐量实验血糖值测定结果推测（x±s，n=10）

1.3 试剂配制

1.3.1 按照禁食24h后空腹体重计算称取STZ和ALX试剂，分别溶于注射用生理盐水中，配制成浓度为1.2%和1.3%的溶液，由于两种水溶液不稳定，配制后需立即进行腹腔注射。

1.3.2 干预用保健食品按其推荐剂量，加纯净水配制成16%的水溶液。

1.3.3 葡萄糖溶液配制浓度为10%，纯净水溶解。

1.4 方法

1.4.1 高血糖模型的建立 动物购入后，适应环境3天，按体重随机分为两组，每组45只小鼠。将两组动物禁食（不禁水）4h后，尾部末梢血测定空腹血糖，作为两组动物的基础血糖，即造模前血糖。随后，禁食24h（自由饮水），分别腹腔注射剂量为120mg/kgBW的STZ溶液和130mg/kgBW的ALX溶液造模。6天后动物禁食4h，血糖仪测血糖，血糖值10～25mmol/L为高血糖模型成功动物。比较两组的成模率和死亡率。

1.4.2 糖耐量实验 选高血糖模型动物按禁食4h的血糖水平随机分成4个组，分别是STZ模型组、STZ干预组、ALX模型组和ALX干预组（组间差不大于1.1mmol/L）。干预组经口给予保健食品，模型组给予纯净水，连续30天。各组动物禁食4h小时，血糖仪测定给葡萄糖前（即0小时）血糖值，干预组最后一次给予保健食品，模型组给予同体纯净水，20分钟后各组经口给予葡萄糖2.0g/kg BW，剪尾测定给予葡萄糖后各组0.5h、2h的血糖值。

1.5 观察指标

1.5.1 体重 动物适应环境后称量体重即实验前体重；成模分组后体重及糖耐量实验（实验结束前）禁食前体重。

1.5.2 血糖值 造模前基础血糖值；造模后血糖值；糖耐量实验中0h、0.5h和2h血糖值及血糖仪HI值的出现频率比较；比较生化仪和血糖仪测定血糖值。

1.5.3 观察造模后比较STZ和ALX的成模率和死亡率以及分组后的死亡率。

1.5.4 观察实验中动物的精神状态、进食量、饮水量及排尿量。

1.6 数据处理 数据用均数和标准差（X±S）表示，采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，体重和血糖值采用单因素方差分析，HI值的出现频率、成模率和死亡率采用卡方检验，仪器比对血糖值采用t检验，P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 建模后动物的大体观察 建模后小鼠饮水及排尿量明显增加，进食量正常，皮毛蓬松，精神尚可。1只出现尾部溃烂，2只出现前肢溃烂。尾部溃烂可能与多次取血有关，而前肢溃烂可能为高血糖的并发症所致。

2.2 体重变化 两种药物诱导小鼠高血糖模型体重变化见附表1。两种药物诱导在造模前、造模后6天和36天时的体重均无显著性差异（P＞0.05），但是ALX干预组在造模后6天体重出现略微下降，ALX两个组的体重标准差（4.75；3.49）均大于STZ诱导的两个组（1.45；1.93）。

2.3 血糖值的变化、成模率和死亡率两种药物造模结果的比较见附表2。造模前与造模6天血糖值均无显著性差异（P＞0.05），但ALX组6天血糖值（16.08；16.22）高于STZ组（13.85；13.90），存在生物学意义；成模率和成模前后的死亡率均无统计学上的显著性差异（P＞0.05）。ALX组成模率稍低于STZ组，死亡率出现在ALX组成模期间和STZ干预组成模后。

2.4 糖耐量实验结果

附图 STZ组与ALX诱导小鼠高血糖模型血糖水平变化

2.4.1 HI值的出现 在糖耐量实验中，用血糖仪测定尾部末梢血糖值时出现了“HI”值情况，提示测定结果超过了仪器的检测上限，通过统计出现的这种情况（见附表3），发现两种药物诱导模型在0.5h时存在明显的差异，具体表现在ALX模型组出现HI值数量明显少于STZ模型组（P＜0.01）；ALX干预组出现HI值数量少于STZ干预组（（P＜0.05）；综合两者出现情况统计出现率，ALX组出现HI值频率明显少于STZ组（P＜0.01）。在0h和2h时，两组HI值出现没有统计学差异，但总体上在这两个时间点ALX组也有少于STZ组的趋势。

2.4.2 血糖值测定结果推测 由于HI值的出现，血糖值无法准确到数值，根据血糖仪检测限值（0.6～33.3mmol/L），假设HI值均为≥33.4mmol/L，得到下面的结果（见附表4），与造模结果不同，ALX诱导的两个组别血糖值在3个时点均低于STZ诱导的组别，且ALX模型组在0h和2h由于没有出现HI值情况所得数值为真实血糖值（x ±s）。

通过以上实验可以得出两种药物诱导血糖值变化曲线见附图（排除保健食品影响，只显示STZ模型组和ALX模型组的血糖变化）。

附图显示，STZ组与ALX组在造模前血糖值几乎没有差异，随着造模开始，ALX组（16.08±4.01）在第6天的血糖已经超过了STZ组（13.85±4.27），而在36天时，STZ组（22.22±8.43）的血糖因为持续升高反而高于ALX组（16.44±8.58）。

3 讨论

采用药物建立糖尿病动物模型受多种因素影响，包括动物种属、性别、体重、药物种类、给药次数、给药途径、溶媒及剂量等。本研究所选择的药物STZ和ALX诱导高血糖动物模型的机制都是选择性地破坏β细胞，使胰岛细胞分泌功能丧失，造成胰岛素缺乏，引起内分泌功能及三大物质代谢紊乱，从而使血糖升高。

实验结果表明，两种药物诱导的小鼠没有表现出明显的“三多一少”的症状，与相关学者的研究结果相同。但造模后6天时，体重上升并不明显，说明两种药物对于小鼠造模后短期体重存在一定的影响，ALX模型组还出现了微降的现象，ALX组体重标准差大于STZ组，ALX的诱导可能对于体重的影响更大。ALX组出现动物死亡的情况，是由于造模后动物一度处于低血糖期，血糖过低可致惊厥死亡[3]。而STZ组在糖尿病期出现的死亡，可能与个别动物的胰岛β细胞呈现较持续的、严重的损伤与破坏导致机体免疫力下降有关。从6天血糖值可以看出，ALX较STZ在ICR小鼠体内更为敏感，存在生物学意义。而成模率则STZ组略高于ALX，是由于ALX诱导产生的低血糖相较为严重，出现动物死亡，如果能在造模后及时给予一定质量分数的葡萄糖就可以降低死亡率，同时有助于提高成模率。

血糖仪由于其采血便捷、方便携带、检测快速等优势成为测定血糖的常用仪器，糖尿病的研究也多采用血糖仪。在糖耐量实验中，我们发现使用血糖仪测定会导致实验结果出现缺失的现象，并且ALX和STZ诱导产生的结果存在显著性差异，这种差异主要体现在血糖仪HI值（超过仪器检测上限值）的出现频率上。为了更真实的反映结果，我们采用了一种保健品进行干预，模拟保健食品辅助降血糖功能评价实验的某个剂量组给药30天，发现干预组在0h就会出现HI值，0.5h出现数量达到高峰，并且ALX干预组少于STZ干预组（P＜0.05），而在模型组产生的差异更为明显（P＜0.01），评价总的HI值出现率，ALX组同样明显少于STZ组（P＜0.01）。在2h时ALX模型组恢复到0h的情况，没有出现HI值，而其他组别虽然数量均有下降，仍然有HI值出现。上述现象出现的原因可能与参与干预的保健品有关，此次使用的为含辅料样品，因此在最后一次空腹给药会使血糖值升高，随后在给予葡萄糖时产生蓄积作用，使血糖值浓度太高而超过血糖仪的检测上限。总体来看，STZ对葡萄糖过于敏感，ALX对于血糖蓄积升高的影响较小。继续分析糖耐量实验的血糖值变化，经假设推测可以得出ALX组在3个时点的血糖值都要低于STZ组的结论，这也与上面HI值出现的结果统计有相辅相成的关系，同时也对STZ模型组在0小时出现HI值的现象提供了依据。并且，根据各期血糖值，我们绘制出STZ和ALX诱导小鼠高血糖模型血糖值变化图，ALX组在造模后血糖升高迅速，36天血糖值与6天基本相当，血糖浓度仍然保持较高水平，没有出现自发缓解现象；STZ组血糖升高比ALX组有延迟，36天血糖与6天时比较上升明显，出现HI值的风险加大。两者比较，ALX在不超过5周给药周期的降血糖实验中能够获得相对理想的结果。

综上所述，通过比较两种药物诱导小鼠高血糖模型在降糖实验中的效果，尽管ALX毒性大，对造模动物的体重等指标存在影响，但由于其造模速度快，动物的高血糖浓度较稳定且维持时间较长，并且价格低廉，仍然是建立高血糖动物模型的首选药物。同时在采用ICR小鼠进行保健食品降血糖功能实验时，受试物应该去除辅料以避免对糖耐量实验结果的干扰。