塞来昔布和5-FU联用对人胃癌细胞增殖、VEGF和Survivin表达的影响

扬州大学临床医学院（扬州市苏北人民医院）（225001）宋树祥 陈平 柳欣欣 赵艳

胃癌的发生、发展与多种细胞因子的过度表达相关。近年来研究表明选择性环氧化酶-2（COX-2）在胃癌细胞中大量表达，其抑制剂对胃癌是否有抑制作用一直是研究热点[1]。很多研究者通过基础及临床的多种研究认为，COX-2抑制剂在抗肿瘤方面有重要作用，尤其是消化系统肿瘤，虽然COX-2抑制剂在肿瘤发展过程中的具体机制仍未阐明，但其作用明显抑制肿瘤细胞生长。COX-2、血管内皮生长因子（VEGF）以及凋亡相关基因Survivin之间可互相调节、协同作用，共同促进肿瘤的生长、侵袭和转移[2][3]。我们应用选择性COX-2抑制剂塞来昔布作用于胃癌细胞株，观察其对胃癌细胞增殖的影响；并将其与治疗胃癌的常用化疗药物5一氟尿嘧啶(5-FU)联用，探讨两者抑制胃癌细胞增殖、诱导凋亡可能的协同作用和相关的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 材料①实验细胞：人胃癌细胞株BGC-823系购自中国科学院上海细胞库。②主要试剂：塞来昔布购自美国辉瑞公司，5-FU购自Sigma公司；RPMI-DMEM培养基购自美国GIBCO公司、胎牛血清和胰蛋白酶购自杭州四季青公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）及二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；RNA提取试剂盒购自北京天根公司，RT-PCR试剂盒购自南京唯赞生物科技公司；Marker、VEGF、Survivin、β-actin引物由深圳华大基因公司合成；③主要仪器：酶标仪、梯度PCR仪、核酸扩增仪、电泳槽、凝胶成像分析系统。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 BGC-823胃癌细胞培养使用RPMI-DMEM培养基，使用时均加入10%的小牛血清和双抗（100U/mL青霉素和100U/mL链霉素），置细胞于含有5%的CO2、37℃饱和湿度的细胞培养箱中培养，该细胞系在培养皿中贴壁生长，待细胞长到整个培养皿的85%～90%，用0.25%胰酶消化传代，实验用细胞已传至8代。

1.2.2 MTT比色分析法 选择对数生长期的BGC-823细胞，2.5g/L胰蛋白酶消化，以RPMl-DMEM培养基调整细胞悬液浓度为1×108/L，接种于96孔板(1×104/孔)，每孔接种100uL，贴壁24h后，分别加入含有不同浓度(0、100、200、300、400umoL/L)塞来昔布孵育24h、48h、72h后分别加入MTT，再孵育4h，弃去孔内液体，加入二甲基亚砜，在酶标仪490nm波长处检测各孔吸光度(A)值，抑制率=(1-实验组A/对照组A)×100%，对照组中细胞培养为普通营养液加入相同含量DMSO混合液。边缘空以PBS覆盖减少实验误差。

1.2.3 逆转录聚合酶链反应 以cDNA为模板，进行PCR反应以扩增VEGF和Survivin基因序列，选择β-actin作为内参照。细胞接种于6孔板中，贴壁后分别用塞来昔布IC50、5-FU（200umoL/L）及塞来昔布联合5-FU孵育48h。收获细胞1×107，RNA试剂盒法提取细胞总RNA。取5ulRNA按照Vazyme试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA. RNA500/检测浓度。以cDNA为模板，进行PCR反应以扩增VEGF和Survivin基因序列，选择β-actin作为内参照。引物序列设计：VEGF上游引物为：5’-ATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3’，下游引物为：5’-TGCATGGTGATGTTGGAC-3’，扩增片断大小为382 bp，Survivin上游引物为：5’-GGCATGGGTGCCCCGACGTT-3’，下游引物为：5’-AGAGGCCTCAATCCATGGCA-3’，扩增片段大小为439bp，内参β-actin的上游引物为：5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’，下游引物为：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’，扩增片段大小为564bp。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共扩增35个循环。72℃彻底延7min。将扩增产物在70～80V电压下电泳，30min后于凝胶成像及分析仪上进行图像成像，将电泳结果放在凝胶成像分析仪中分析结果。

附图1 不同作用时间塞来昔布对BGC-823胃癌细胞lC50值

附图2 M：Marker；A：对照组；B：塞来昔布200umoL/L；C：5-FU200umoL/L；D：塞来昔布+5-FU200umoL/L

附图3 M：Marker；A：对照组；B：塞来昔布200umoL/L；C：5-FU200umoL/L；D：塞来昔布+5-FU200umoL/L

1.3 统计学方法 结果采用方差分析，两样本均数采用t检验，数据以x±s表示，数据处理采用SPSS19.0统计学软件。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 塞来昔布对BGC-823胃癌细胞增生的影响 随着药物浓度升高和时间延长，BGC-823胃癌细胞活性明显下降，24h、48h、72h塞来昔布干预BGC-823胃癌细胞IC50为(255.36±21.1)umoL/L、(149.12±2.29)umoL/L、(89.95±1.61)umoL/L(见附图1)。

2.2 塞来昔布联合5-FU对VEGF和Survivin mRNA表达的影响 VEGF和Survivin mRNA在BGC-823胃癌细胞中表达正常。塞来昔布和5-FU联用可完全抑制VEGF和Survivin mRNA在BGC-823胃癌细胞中的表达，单独用药组也可抑制VEGF和Survivin mRNA的表达，但抑制效果无联合应用显著，见附图2、3。

3 讨论

近年来，COX-2在消化道肿瘤中所起的作用日益受到重视。COX-2又称前列腺素内过氧化物合成酶，具有环氧合酶和过氧化物合成酶的功能，主要分布在肿瘤组织和肿瘤微血管组织中，在多种肿瘤组织和转移灶中高表达，可促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤血管生成，增加肿瘤浸润转移能力，抑制机体免疫功能，从而促进肿瘤的发生、发展和侵袭、转移等[4][5]。

COX-2选择性抑制剂塞来昔布在很多动物模型中抑制肿瘤的发生：在偶氮甲烷所致的鼠大肠癌模型中，塞来昔布可使大肠癌的发生率和肿瘤数量分别减少93%和97%，并抑制异常结肠腺管灶的形成[6]。在体外培养细胞中，研究发现塞来昔布对肝癌HepG2细胞株[7]及SMMC-7721细胞株阳[8]、结肠癌细胞株HT-29[9]，均有程度不同的抑制率。但是塞来昔布抑制肿瘤发生的机制目前还不十分清楚，这种作用可涉及多方面：如抑制肿瘤血管的形成[10]，抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞亡，对磷酸化ERK表达的影响，并有可能逆转肿瘤消耗引起的消瘦而对正常细胞的结构、凋亡无明显影响[11]。目前，关于COX-2抑制剂对肿瘤的抑制作用及其机制的研究已成为热点。我们研究选择性COX-2抑制剂塞来昔布和5-FU联用对胃癌细胞杀伤和诱导凋亡抑制VEGF以及Survivin mRNA的表达的作用，其目的是为临床化疗药物和选择性COX-2抑制剂联合抗肿瘤治疗新思路的实行提供一些理论依据。本研究中，我们应用塞来昔布干预BGC-823胃癌细胞，通过计算塞来昔布对BGC-823胃癌细胞的IC50值，从而明确，浓度梯度不变，随着时间延长，BGC-823胃癌细胞增生受到抑制。

VEGF的表达与肿瘤的生长速度、微血管密度、血管结构及肿瘤转移等肿瘤的多种生物学特征有密切关系[12][13]。COX-2主要表达在新生的血管内皮细胞和形成血管的细胞中，目前认为COX-2主要通过以下几种途径促进肿瘤血管的生成：一方面COX-2可使肿瘤中VEGF的表达上调，抑制COX-2可抑制VEGF的表达；另一方面VEGF又可上调COX-2的表达，从而形成一个正反馈网络，协同刺激肿瘤血管生成[14]。研究认为COX-2可以促进肿瘤生长，从而导致肿瘤组织局部呈缺氧状态，此时HIF-1被迅速激活，激活后的HIF-1又可以促进VEGF的转录，增加VEGF的表达。

随着新的凋亡抑制家族成员的发现，很多肿瘤中发现Survivin高表达，包括肺癌、直肠癌、胰腺癌、前列腺癌及乳腺癌[15][16]。Srvivin是一种新发现的抑制细胞凋亡的蛋白IAP家族成员，定位于人染色体17q25上。其在肿瘤细胞凋亡调控方面发挥至关重要的作用。很多学者集中研究Survivin与胰腺癌的关系。Satoh等[17]列发现，在胰腺导管癌中Survivin表达率为76.9%，导管乳头状钙黏蛋白瘤中表达率为56.3%。Survivin在恶性肿瘤中的表达远远高于良性肿瘤的表达。Survivin的主要作用为抑制肿瘤细胞凋亡和促进细胞增殖，是迄今发现的最强的凋亡抑制基因，同时也是预后不良的因素之一。因而，其已经成为肿瘤靶向治疗的一个新靶点。国外对前列腺癌和大肠癌的研究表明[18]，选择性COX-2抑制剂可通过抑制survivin表达而达到治疗肿瘤的目的。然而也有不同意见，Lubet RA和Gradilone A分别通过对膀胱癌和肺癌的研究表明[19]。COX-2抑制剂并不能影响survivin的表达。我们的研究发现，塞来昔布、5-FU及塞来昔布联合应用5-FU均可抑制VEGF和Survivin的表达，并且塞来昔布联用5-FU抑制效果最为明显。

本实验发现，塞来昔布对胃癌细胞BGC-823的生长有抑制作用，同时，对化疗药物的不敏感和耐药是目前胃癌治疗中存在的主要问题。我们的体外研究表明，选择性COX-2抑制剂和5-FU的联用可显著提高胃癌细胞的杀伤率和凋亡发生率。然而，目前对于塞来昔布抑制肿瘤生长的确切机制尚不十分清楚，但我们相信，随着研究的不断深入，选择性COX-2抑制剂和化疗药物的联用有可能成为胃癌治疗的一种新方法。