胰岛素对糖尿病大鼠膀胱逼尿肌病理组织形态学表现的影响

赵　雷　邓远飞　刘　莉

胰岛素对糖尿病大鼠膀胱逼尿肌病理组织形态学表现的影响

赵雷邓远飞刘莉

目的 探讨胰岛素（INS）对糖尿病大鼠膀胱逼尿肌病理组织形态学表现的影响。方法 使用链脲佐菌素（STZ）建立诱导糖尿病大鼠模型，按照随机原则分为INS注射组（28例）与实验观察组（28例），且设置正常对照组（28例）。在7、11周时分别对上述3组大鼠进行膀胱逼尿肌切片标本常规HE染色，并且观察大鼠膀胱逼尿肌在光镜下的组织学形态，并随机选择一些膀胱逼尿肌切片在电镜下进行超微病理检查。结果 在光镜下观察的HE染色石蜡切片中，糖尿病观察组的膀胱逼尿肌肌束之间排列疏松紊乱，间隙显著变宽，胶原组织含量减少，在11周时比7周时更明显；而对照组的膀胱逼尿肌横断切面和纵行切断面所观察的肌束之间排列非常整齐，肌束之间的结构连接紧密，间隙中有丰富的结缔组织；INS注射组与对照组比较无明显差异。在电镜下观察HE染色石蜡切片中，糖尿病观察组肌束内平滑肌细胞（SMC）的细胞直径变大，间隙变小，胶原纤维含量减少，SMC肌膜致密带密度减小，密度带之间分界不清晰，肌膜各区域的密度逐渐相同，肌细胞的中间连接、密斑变少，但仍然可观察到神经；上述改变较少随着时间的增加而改变；INS注射组和对照组的超微结构大体相同。结论 糖尿病大鼠早期即有膀胱逼尿肌组织形态学上的变化，早期注射INS治疗可以对预防和减轻上述变化有良好的效果，可能与INS在预防和延缓糖尿病神经原膀胱的发生、发展方面有关，提示临床医生对临床上已经诊断出患有早期糖尿病神经原膀胱的患者应尽早使用INS治疗。

胰岛素 膀胱逼尿肌 组织学形态 糖尿病

糖尿病会引起较多并发症，糖尿病神经原膀胱是泌尿系统并发症之一，其占糖尿病并发症发病率的40%～60%［1］，早期患者多无明显的临床症状。患者患有糖尿病时，本身的膀胱逼尿肌组织形态上发生了相应的病理变化，但目前而言其病理变化的原因尚未完全明确，所以有必要对其进行深入研究。本研究自2014年8月至2015年1月建立患有胰岛素（INS）依赖型糖尿病的大鼠模型，取实验大鼠的膀胱逼尿肌为观察对象，将大鼠膀胱逼尿肌组织切片的组织形态学改变、电刺激及注射INS后与正常对照组进行一系列比较，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1材料 （1）仪器：血糖仪。（2）药物：链脲佐菌素粉剂（Streptozotocin，STZ，美国Sigma公司）、0.1mol/ L的柠檬酸盐缓冲液、鱼精蛋白锌INS。（3）动物：SD大鼠，雌雄不限。

1.2方法 （1）糖尿病大鼠模型制备：糖尿病大鼠造模方法：首先将造模大鼠禁食10h，将STZ粉剂溶于0.1 mol/L的柠檬酸盐缓冲液，配成质量浓度为10g/L的溶液，按60mg/kg进行腹腔注射，注射后3d取尾静脉血采用血糖仪测定血糖，当血糖＞16.7mmol/L，可以确定为造模成功。注射后4周时再次进行血糖测试确证血糖水平。INS注射组在注射STZ后4d进行皮下注射鱼精蛋白锌INS，注射量为2～6U/次，1次/d，维持血糖6～10mmol/L。每次测血糖均在上午8～10点。（2）动物分组：选取雌性SD 大鼠196只，月龄：5周，体重200～230g，按照实验所需的标准喂养1周后用于实验研究。采取随机数字表的方法留下对照组56只，经STZ腹腔注射造模的大鼠共140只。经STZ腹腔注射的大鼠均在注射3d后测量大鼠的血糖，造模成功的标准为血糖＞16.7mmol/L，造模成功的大鼠有130只，平均血糖（27.2±3.6）mmol/L。用随机数字表的方法将大鼠分为四组：10周STZ组（32只），6周STZ组（30只），10周STZ +INS组（34只），6周STZ +INS组（32只）。饲养中10周STZ组4只死亡，6周STZ组2只死亡，10周STZ +INS组4只死亡，2只未达标，6周STZ +INS组2只死亡，2只未达标。实际完成10周STZ组有28只，6周STZ组有28只，10周STZ +INS组有28只，6周STZ +INS组有28只。设立以下两个对照组： 10周对照组28只，6周对照组28只。（3）电镜下糖尿病大鼠膀胱逼尿肌的病理检查方法：取每一张切片标本3～5张电镜照片进行病理常规观察，用INS注射组所得的电镜照片与对照组相互比较观察。

1.3统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1实验动物一般情况 见表1。

表1　INS注射组及对照组大鼠一般状况（±s）

表1　INS注射组及对照组大鼠一般状况（±s）

注：同时间与对照组比较，*P＜0.01；同时间与其他组比较，#P＜0.01

STZ+INS组10周对照组10周STZ组10周STZ+INS组n282828282828质量（g）221±44219±12220±22222±11217±27220±12第3天血糖（mmol/L）6.3±2.326.8±2.0*27.1±2.6*6.1±3.327.3±5.1*27.5±3.8*第4周血糖（mmol/L）6.5±2.426.2±2.9#6.1±3.46.3±4.125.3±3.5#6.4±3.6麻醉后残余尿（ml）0.06±0.02 0.56±0.40#0.08±0.210.09±0.220.69±0.42#0.11±0.64组别6周对照组6周STZ组6周

2.2电镜下糖尿病大鼠膀胱逼尿肌结构表现形态 （1）对照组：膀胱逼尿肌肌束内的平滑肌细胞（SMC）排列分布均匀，细胞间排列非常整齐。SMC之间存在较多中间连接（Intermediate junction），细胞之间的间隙较小，在细胞间隙中含有少量弹性纤维与胶原纤维。连续排列的细胞肌膜分布在肌细胞四周，低密度带与高密度带（致密带）交替排列，肌膜下可见少量小泡，细胞浆可见大量肌丝及密体，以及线粒体等细胞器。（2）糖尿病观察组：与对照组比较超微结构表现出比较明显的差异：①膀胱逼尿肌肌束内SMC的间隙变小，细胞之间的胶原纤维含量减少，细胞与细胞的距离变短。②肌膜内致密带的密度变小，肌膜密度趋于一致，细胞间的中间连接和密斑均减少。③少量SMC肌膜形成锯齿状突起，两细胞的肌膜吻合交错。④SMC胞浆里线粒体发生变性。⑤神经无明显异常改变，无明显退化仍然可见神经突触内的小泡数量无明显减少。见图1、2。

图 1 6周治疗组电镜图（×20000）

图2　10周治疗组电镜图（×12000）

2.3光镜下糖尿病大鼠膀胱逼尿肌结构表现形态 （1）对照组：在低倍镜下可见膀胱逼尿肌横断切面和纵行切断面的肌束排列整齐、有序。肌束间隙中充满结缔组织，连接紧密，且有许多神经束填充在肌束间隙中。在高倍镜下可观察到SMC之间结构连接紧密，排列整齐。（2）糖尿病观察组：在低倍镜下有明显的黏膜异常改变，固有黏膜发生充血水肿等炎症病变。膀胱逼尿肌肌束之间排列疏松紊乱，部分肌束发生断裂。肌束间的间隙胶原纤维含量减少，间隙明显增宽。肌束之间仍可见神经束，小血管出现充血。并且上述改变在11周时较7周时更加明显。（3）糖尿病INS注射组：与正常对照组比较，低倍镜和高倍镜下表现出的形态无显著差异。见图3。在上述改变中，糖尿病组在11周时比在7周时的改变程度未明显加重。糖尿病INS注射组与正常对照组比较超微结构无明显改变。

图3　10周治疗组病理切片（×40）

3　讨论

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于INS分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病长期存在的高血糖，导致各种组织，尤其是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍，会引起较多的并发症。

糖尿病神经原膀胱是糖尿病最常见的并发症之一，该病有尿频、排尿困难、膀胱残余尿增多、尿潴留、充盈性尿失禁、顽固性尿路感染、肾积水或肾功能衰竭等临床症状的产生，严重影响患者的生活质量，危及患者的身心健康，甚至生命［2］。目前该病治疗方法较多，主要有拟胆碱药物、神经生长因子、手术、电刺激等方法，但均无满意的临床疗效［3］。临床医生只能通过详细询问患者的病史与症状、体格检查再结合括约肌电图检查、膀胱电生理测定、实验室和尿动力学检查等方法的结果确诊糖尿病神经原膀胱。上述诊断的过程复杂且花费时间多，可能导致患者的疾病不能及时发现，如能从病理生理水平去诊断分析，将能早发现、早干预，可最大限度改善患者的预后。因此从病理组织形态学的角度观察糖尿病大鼠膀胱逼尿肌的改变和在INS注射后糖尿病大鼠的膀胱逼尿肌在病理组织形态学变化对临床诊断有较大帮助［4］，可以为临床诊断提供理论依据，做到尽早预防、尽早诊断和尽早治疗糖尿病神经原膀胱。

研究表明，在光镜下观察糖尿病大鼠膀胱逼尿肌产生的最常见病理学异常改变是肌束的体积增大、肌束之间的间隙变大、肌束之间的胶原含量降低、肌束排列疏松紊乱［5］。目前对糖尿病大鼠膀胱逼尿肌产生的一系列形态学上改变的原因尚不清楚，可能因为大鼠患有糖尿病后的神经发生病变。本研究中发现肌束结构排列疏松紊乱，肌束之间的小血管充血水肿。但并未发现膀胱逼尿肌肌束的体积有明显的增大，可能与造模时间比较短，还未出现代偿性肥大有一定的关系。在实验中还发现黏膜下和肌束间的胶原组织含量减少，但并非胶原组织量的绝对值减少。有关研究可以证实膀胱重量和胶原的增加也可以是膀胱部分出口梗阻的原因。细胞增长和胶原形成速度是基本相同的，膀胱总重量与胶原总量的比值将会增加或降低。部分大鼠模型患有膀胱出口梗阻，膀胱逼尿肌增生的速度大于胶原组织生成的速度，虽然胶原组织的含量绝对增加，但胶原组织所占膀胱逼尿肌的比重却会下降，因此胶原浓度也降低。研究中在形态学观察时期能观察到膀胱逼尿肌肌细胞体积肥大，细胞形态表现出多样性，膀胱逼尿肌肌束间、细胞间胶原纤维组织含量减少。实验人员取以前研究有关膀胱出口梗阻继发的肥大细胞与糖尿病大鼠肥大的膀胱逼尿肌的细胞做比较和分析，发现两者间的形态学特征并无差异［6］。故作者认为在研究中糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌的胶原组织相对含量下降和由于膀胱出口梗阻造成膀胱逼尿肌的胶原组织相对含量下降具有相同的原因。因此在光镜下观察时出现肌束之间的胶原纤维含量减少是膀胱逼尿肌的胶原组织相对含量的减少，而并非绝对含量的减少，且在光镜下观察时，上述出现的改变会随造模时间的加长而变得更显著［7］。是由于膀胱逼尿肌肌束结构之间排列疏松紊乱及胶原纤维含量减少才导致膀胱逼尿肌收缩功能的降低，这与作者在膀胱逼尿肌肌条张力和在体膀胱压力测定时所得结论相符合。在光镜下观察INS注射组大鼠的膀胱逼尿肌的组织形态与正常对照组基本相同，因此可以推测INS用于临床治疗糖尿病具有明显的疗效，能明显的预防、延缓糖尿病鼠膀胱组织病理形态学上的改变。

在本次实验中电镜下观察发现，膀胱逼尿肌肌束内SMC的胶原纤维含量减少。与本次实验光镜下的观察具有相同的结果。少量SMC肌膜异常突起呈锯齿状并互相嵌和，胞浆内出现线粒体变性。电镜下神经形态无以上所述变化，但还需深入研究糖尿病晚期的膀胱逼尿肌神经超微结构的改变。在电镜下观察到肌细胞胞浆内出现线粒体空泡变性，因为线粒体是为细胞能量的供应站，所以其改变对细胞的能量供应产生较大影响，可能造成膀胱逼尿肌收缩力下降。在电镜下INS注射组大鼠膀胱逼尿肌组织形态上和正常对照组大体相同。通过对INS注射组大鼠的膀胱逼尿肌在电镜下形态的表现并与正常对照组的比较的研究，推测INS可以有效治疗糖尿病并发症中的糖尿病神经原膀胱，对预防、延缓早期糖尿病神经原膀胱的发生有重大的临床意义，这与INS的胰外作用或INS降低血糖有一定关系。

综上所述，糖尿病早期会出现膀胱逼尿肌组织形态学上的改变，并会影响膀胱的收缩功能，INS治疗可以有效的预防和延缓糖尿病神经原膀胱的发生。因此诊断出患有糖尿病神经原膀胱的患者应尽早使用INS治疗，做到早发现、早治疗。

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Objective To study the insulin（INS）on diabetic rats bladder tissue morphology performance forced urinous myopathy. Methods Use chain urea with cephalosporins（STZ）induced diabetic rats model was established，based on the principle of random divided into insulin injection group（28 cases）and the experimental group（28 cases），and set up the normal control group（28 cases）.At 7，11 w，respectively，for the above three groups of rats bladder detrusor biopsy specimens of routine HE staining，and observed the rat bladder detrusor histological morphology under light microscopy，and randomly selected some of the bladder detrusor slice ultrastructural examination under the electron microsco.Results Under light microscopy observation of paraffi n section，HE dyeing diabetes group between the bladder detrusor muscle bundles of loosely arranged disorder，gap widened signifi cantly，reduce collagen content，in the 11 w was more obvious than when 7 w；And the control of the bladder detrusor cross sectional plane and longitudinal cut surface was observed between muscle bundle arrangement was very neat，the structure of the connection between muscle bundles were tight，clearance was rich in the connective tissue；.Insulin injection group compared with the control group had no obvious difference.HE dyed in paraffi n section，when observed under electron microscope， diabetes group within the muscle bundle of smooth muscle cells（SMC）had larger cell diameter，smaller gap，and collagen fi ber content reduce，SMC muscle membrane density decreased density，density zone between the boundary was not clear，the density of various regions gradually the same muscle membrane，muscle cells in the middle of the connection，tight spot less，but still can be observed nerve；The above change little with the increase of time and change；Ultrastructure of insulin injection group and the control group in general were the same. Conclusions Are laid down early diabetic rats bladder detrusor change of tissue morphology，early insulin therapy to prevent and reduce the effect of these changes are good，may be related to insulin in the prevention and delay the occurrence and development of diabetic neurogenic bladder with help，So prompt clinicians to have clinical patients diagnosed with early diabetic neurogenic bladder should use insulin treatment as soon as possible.

Insulin Bladder detrusor Histological appearance Diabetes

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