日粮中不同稻壳替代水平对19～28日龄仔鹅肠道微生物区系的影响

蔡中梅，王志跃，杨海明

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009）



科学实验研究

日粮中不同稻壳替代水平对19～28日龄仔鹅肠道微生物区系的影响

蔡中梅，王志跃*，杨海明

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009）

本试验旨在利用PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）技术研究日粮中不同稻壳替代水平对19～28日龄扬州鹅肠道微生物区系的影响。选用19日龄扬州公鹅260只，随机分成4组，每组5个重复，每个重复13只。A组饲喂基础日粮，B、C、D组分别饲喂7%、14%、21%稻壳替代的基础日粮。在28日龄时采集各肠段内容物进行总DNA的提取，对细菌16S rRNA V3区用细菌通用引物进行PCR扩增，利用DGGE电泳技术分析肠道微生物区系。结果显示：不同稻壳替代水平对十二指肠、空肠、盲肠菌群条带总数量影响不明显，但共有条带存在一定差异；十二指肠、空肠各组间菌群相似性程度均较低，盲肠组间相似性程度最高。由此可见，不同程度的稻壳替代能够影响肠道菌群分布，其中对十二指肠、空肠影响较大，对盲肠影响较小。

扬州鹅；稻壳替代水平；变性梯度凝胶电泳；微生物；肠道

鹅是草食性动物，在其空肠后段、回肠、盲肠内存在大量微生物，所以鹅在利用粗纤维方面具有较大优势。Hamer（2008）认为，纤维物质能为肠道微生物菌群提供能量。此外，微生物菌群对纤维类物质进行代谢可产生营养物质，如短链脂肪酸、维生素、氨基酸等。战利（2012）研究指出，高水平纤维日粮能显著影响鹅肠道微生物菌群多样性。刘蓓一（2012）研究发现，不同纤维水平对鹅盲肠菌群的调控起主要作用，盲肠微生物种类会随着纤维水平的提高而增加，且盲肠中以不可培养的细菌为主。

以前微生物研究大多采用传统的分离培养方法，重复性差，且绝大多数肠道菌群需要厌氧环境，而目前厌氧培养技术还不是很完善。随着16S rRNA为基础的分子生物技术的不断发展，许多可鉴定不可培养微生物新技术相继出现。变性梯度凝胶电泳（DGGE）因其准确、重复性好等优点，在动物胃肠道菌群研究方面得到了广泛的应用。本试验拟用PCR-DGGE技术研究不同稻壳替代水平日粮对扬州鹅各肠段微生物区系的影响，为进一步探讨鹅消化纤维机制积累理论基础。

1　材料与方法

1.1试验设计试验选用260只健康、体重基本一致的19日龄扬州鹅公鹅，随机分为4组，每组5个重复，每个重复13只。其中A组饲喂基础日粮，B、C、D组分别饲喂7%、14%、21%稻壳替代日粮。

1.2日粮组成与饲养管理基础日粮参照美国NRC标准（1994）、前苏联畜牧科学研究所（1985）的建议及本教研室历年研究成果进行配制（张宏福，1995），基础日粮组成及营养水平见表1。试验鹅采取网上平养，自由采食饮水，常规免疫程序免疫。

表1　基础日粮组成及营养水平（风干基础）

1.3样品采集于28日龄宰杀试验鹅，每组取5只，无菌操作，取各肠段内容物，将同组5只鹅的各肠段内容物均匀混合，并快速置于-70℃保存备测。

1.4试验方法

1.4.1肠道菌群总DNA的提取按照TIANamp Stool DNA Kit（TIANGEN）试剂盒的使用说明来提取鹅各肠段微生物总DNA。提取好的DNA置于-20℃冰箱保存备用。

1.4.2总DNA的定量及纯度检测DNA的含量用Spectrophotometer DNA定量仪（Thermo公司）进行测定，采用OD260/OD280方法检测DNA的纯度。用0.8%琼脂糖电泳检测DNA片段的大小。

1.4.3总DNA的PCR扩增利用大肠杆菌16S rRNA V3区的片段基因设计合成通用引物。F338-GC为5’端加40个碱基的“GC”发夹：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC ACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'与R518：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。PCR反应体系及反应条件按照2×Tap PCR MasterMix（TIANGEN）试剂盒使用说明进行操作。最后用1.0%琼脂糖电泳对PCR产物进行检测。

1.4.4变性梯度凝胶电泳用8%的聚丙烯酰胺凝胶对上述扩增产物进行电泳分离。变性剂浓度为45%～60%。在1×TAE缓冲液、80 V、60℃条件下电泳12 h。电泳结束后用硝酸银溶液染色，显影后在Vilber凝胶成像扫描系统上进行成像。

1.5数据分析使用Quantity One分析软件包（Bio-rad公司）对各条带进行分析。通过相似性指数（Cs）来比较不同稻壳替代水平日粮对鹅各肠段微生物多样性的影响，计算公式如下：

式中：Nx为x泳道的条带数；Ny为y泳道的条带数；j为2个泳道共有的条带数。

2　结果与分析

2.1肠道微生物总DNA及PCR产物大小试验结果表明，除回肠之外，各肠段DNA纯度较高，DNA片段大小在23 kb左右。由图1可见，总DNA经16S rRNA V3区引物扩增后可得到约200 bp的扩增产物，效果较好，可用于后续的DGGE分析。

图1　各肠段菌群16S rRNA V3区PCR扩增

2.2不同稻壳替代水平对肠道微生物区系的影响各试验组样本经DGGE分离出数目不一样的电泳条带，且条带在迁移率及强度上存在一定的差异（图2）。十二指肠、空肠、回肠、盲肠的平均条带数为16.25、16、9.25、30.5条，说明鹅盲肠菌群最丰富，其次是十二指肠和空肠，回肠菌种最少，尤其是D组回肠微生物条带仅为4条。

由图2可知，十二指肠各处理组间条带数量相近，但共有性条带较少，差异条带较多。如1是A、B、D组共有条带，C组和D组之间存在差异条带2、3，差异不明显，A组和B组之间存在差异条带4、5、6，A组和C组虽然条带数相同，但差异条带较多。相比于十二指肠，空肠各组间共有条带相对较多，且21%稻壳替代组微生物条带数最多。回肠微生物数量最少，其中D组只有4个条带，除了A组和B组含有较多共同条带，其他各组间菌群组成差异较大，只有1种相同微生物甚至没有，如A组和D组。盲肠各处理组间条带迁移位置相近，不同处理组间大部分为共性条带，但也有差异性条带。如图中a、b是前三组的共有菌，不存在于D组中，而c代表的微生物存在于B、C、D组，在A组中不存在。A组和B组之间存在差异条带e、f和g等。

图2　各肠段微生物DGGE电泳条带示意图

除此之外，各处理组间部分条带的粗细有所不同。条带的粗细不同表明微生物DNA浓度有差异。条带越粗，代表该种微生物含量越高，反之则越少。

2.3不同处理组间菌群相似性分析Cs值越大，表明两组样品的相似性程度越高。由表2可知，十二指肠各组间相似性程度都较低，其中A组和C组相似性指数最低，仅为28.6%，说明两组间差异条带较多。空肠各组间相似性指数较小，但与十二指肠相比，其组间相似性程度稍高。回肠各组间除A组和B组相似程度较高之外，其他各组间几乎没有相似性。盲肠各组相似性程度最高。其中B组和C组之间相似性指数最大，为87.1%。A组和D组之间相似性程度最低，为73.3%，说明两组之间差异条带相对较多。随着稻壳替代比例的增加，D组与其他3组条带相似性程度都相对较低。

表2　各肠段4组间主要菌群的相似性分析指数

3　讨论

即使在相同日龄、环境、日粮营养水平等条件下，宿主微生物菌群也会表现出不同的DGGE指纹图谱，说明个体对肠道菌群组成影响很大。不同个体肠道菌群分布、种类及数量均有差异。van der Wielen等（2002）研究指出，同一日龄肉鸡即使饲养在相同环境中并且饲喂同种饲料，结果微生物菌群却呈现出不同的带谱，表明个体因素对肠道细菌群落组成具有重要影响作用。陈波等（2012）研究表明，影响肠道微生物多样性的因素有很多，其中肠道菌群结构因个体差异而极为不同。Cong等（2007）对2～15只鸡分别混合后的样品图谱进行观察与分析，结果发现5个以上的个体样品混合才能代表整体菌群组成。所以为了尽可能避免个体因素而引起的差异，本试验每组采集5只鹅各肠段内容物均匀混合以便提取的总DNA更具有代表性。

微生物菌群数量的多少依赖于日粮成分和营养浓度的变化。Awati（2005）研究指出，日粮组成影响健康动物肠道菌群中的优势菌种，其中日粮纤维影响较大。鹅与其他家禽不同，其盲肠中存在大量微生物，能够消化利用适量的粗饲料。日粮纤维可作为碳水化合物被体内微生物发酵，部分分解成挥发性脂肪酸被动物吸收利用。党国华和王恬（2005）研究指出，鹅消化粗纤维所获得的能量中6%～18%来自于纤维素，2%～4%来自于半纤维素。本试验结果表明，随着稻壳替代比例增加，盲肠微生物多样性最丰富，且条带也呈增加趋势。这与刘蓓一（2012）、张名爱等（2007）研究结果一致，他们认为不同纤维水平的日粮主要对鹅盲肠菌群多样性起主要作用，盲肠中微生物种类随纤维水平的提高而增加。胡敏华和胡民强（2010）研究指出，日粮中粗纤维水平在5.03%～8.98%，肉鹅肠道内乳酸杆菌的数量随着纤维水平的上升而显著增加，其可能的原因是家禽内源性消化酶不能降解非淀粉多糖，致使其中的养分流入后段肠道，从而引起细菌的增殖。

图谱中条带的数量及位置反映了微生物菌群的多样性。本试验中，28日龄雏鹅十二指肠、空肠、回肠、盲肠的平均条带数分别为16.25、16、9.25、30.5。其中回肠微生物含量最少，盲肠微生物多样性最丰富，盲肠段A组和B组虽然条带数相同，但相似性指数仅为79.3%，说明对日粮进行7%稻壳替代会使两组差异条带数增加。D组与其他各组相似性程度相对较低，原因可能是随着稻壳替代比例的增加，D组菌群结构发生改变，且部分条带的种类和数量可能也会相应发生变化。可见，日粮中纤维水平的增加，会促使盲肠段部分微生物菌种的出现或数量的增加。至于菌种及其数量还需进一步的克隆测序及细菌定量测定来完成。

4　结论

4.1随着稻壳替代比例的增加，十二指肠、空肠菌群条带数相对较稳定，盲肠微生物条带数呈现增加趋势，但差异不大。

4.2十二指肠、空肠各组间菌群组成差异较大，盲肠各组间菌群组成相似性程度较高。

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This experiment was conducted to study the effects of different proportions of rice husk replaced diets on intestinal microflora of geese from 19～28 days by denaturing gradient gel electrophoresis.Two hundred and sixty 19-dayold healthy Yangzhou geese were randomly assigned into 4 groups with 5 replicates of 13 geese each.The control group（A）were fed with basic diet（A）；groups B，C，D were fed with 7%，14%，21%rice husk replaced diets，respectively.The genomic DNA was extracted from the content of various intestinal segments at the age of 28 days.The V3 variable region of bacterial 16S rRNA was amplified with universal primer.Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of the amplicons were analyzed.The results showed that different proportions of rice husk replaced diets had no significant effects on the band quantity of microflora in duodenum jejunun，and cecum of geese，the common bands were different.And different proportions of rice husk replaced diets had no significant effects on the microflora similarity degree in duodenum and jejunum，the similarity index in cecum was maximal.Therefore，different proportions of rice husk replaced diets mostly affected intestinal microflora of duodenum and jejunum and rarely affect the cecum.

Yangzhou geese；rice husk replaced level；denaturing gradient gel electrophoresis；microflora；intestine

S815

A

1004-3314（2016）03-0009-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160302

国家现代农业产业技术体系（CARS-43-27）；扬州大学“新世纪人才工程”资助