枇杷多糖对草金鱼免疫特性的影响

刘成荣

(1.莆田学院环境与生物工程学院，福建　莆田　351100；2.福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室，福建　莆田　351100)



枇杷多糖对草金鱼免疫特性的影响

刘成荣1，2

(1.莆田学院环境与生物工程学院，福建莆田351100；2.福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室，福建莆田351100)

研究枇杷多糖对草金鱼Carassiusauratus免疫功能的影响，为水产动物病害的防治及充分利用枇杷资源提供依据。以草金鱼为试材，通过注射的方式免疫草金鱼，研究枇杷多糖对草金鱼超氧化物歧化酶、溶菌酶、酚氧化酶、白细胞吞噬率的影响，结果表明：注射枇杷多糖质量浓度为1.0 mg·mL-1，免疫21 h时草金鱼血液SOD、溶菌酶活性均达到最大，分别为37.8 U和128 U；注射枇杷多糖质量浓度1.5 mg·mL-1,免疫28 h时，草金鱼血清酚氧化酶活力和白细胞吞噬率均达最大，分别为4.1 U、55.68%，说明枇杷多糖可以提高草金鱼的免疫功能。

枇杷；多糖；草金鱼；免疫

随着水产养殖业的不断发展，高密度养殖使水产动物的免疫力下降，对病原体的抵抗力降低，用抗生素治疗水产动物的病害会发生抗药性、药物残留及环境污染等问题，虽然使用疫苗可以防治水生动物的病害，但易出现抗原特异性、价格问题及免疫途径等问题。因此要寻找对环境无污染、无残留的鱼类病害防治的有效方法显得非常必要。免疫增强剂可以有效提高鱼类免疫力[1]。几千年来，我国劳动人民用中草药来提高人们的免疫力。多糖是中草药中的主要成分，是有效的免疫增强剂，据报道，黄芪多糖、香菇多糖等都能提高水产动物的免疫力和对疾病的抵抗力[2-3]。枇杷是我国传统的食药兼用园艺植物，包含枇杷多糖等有效的成分，枇杷多糖是由同种单糖和异种单糖聚合而成的[4-6]，有关枇杷多糖对水产动物免疫功能的影响尚未见有报道。本试验通过注射的方式免疫草金鱼，在一定时间测定鱼体超氧化物歧化酶、溶菌酶、酚氧化酶的活性和白细胞吞噬率等，研究枇杷多糖对金鱼免疫功能的影响，以期为水产动物病害的防治及充分利用枇杷资源提供依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

金鱼品种为草金鱼，枇杷多糖(从枇杷叶中提取)，提取方法参照参考文献[4-6]，用蒸馏水溶解配成多糖溶液，主要试剂为分析纯的试剂。

1.2试验方法

在注射的第7、14、21、28、35 h分别每重复随机取5尾鱼进行指标测定，尾静脉采血，血液分为两部分，一部分血液离心得血清备用，测定SOD、溶菌酶、酚氧化酶。另一部分制备抗凝血用于测定白细胞吞噬率。

1.2.2SOD活性测定 SOD测定采用邻苯三酚自氧化方法[7]。50 mmol·L-1的Tris-HCl(pH=8.2)缓冲液3 mL,预热至25℃,加入10 mL 50 mmol·L-1的邻苯三酚,充分摇匀,以缓冲液做空白对照,在波长325 nm处每隔30 s测定吸光度1次。同样条件,加入10 μL待测液,读取其吸光度。测定3 min内每分钟吸光值的变化。酶活性计算公式：U/mg=(0.070-△A325) ×100%×V总/[0.070×50%·V0· VS]。其中：△A325：反应吸光值变化值；V总：反应总体积(mL)；VS：加入样品液的体积；V0：活力单位定义体积(1 mL)。

1.2.3血清溶菌酶活性的测定 溶菌酶的测定采用比浊法[8]。以溶壁微球菌(本单位保存的菌种)为底物，用0.1 mol·L-1，pH6.4的磷酸钾盐缓冲液配成底物悬液(OD570nm=0.3～0.5)。取3 mL该悬液于试管内加入50 μL待测血清、混匀,测吸光值A0。然后将试管移入37℃水浴中30 min，取出后立即置于冰浴中10 min终止反应，测其570 nm处的吸光值A。按公式计算溶菌酶的活性:U=(A0-A)/A。

1.2.4酚氧化酶(PO)的测定参照文献[9-10]，采用比色法进行酚氧化酶活力测定。将0.1 mol·L-1磷酸钾(3mL)与0.01 mol·L-1-DOPA(50 μL)及血清(50 μL)混合，在15 min内每隔3 min在490 nm下测吸光度(OD490nm)，得光密度随时间变化的增长曲线，以 OD490 nm对反应时间(min)作图，以试验条件下每分钟 OD490 nm增加0.001定义为1个酶活力单位。

1.2.5白细胞吞噬率的测定参考叶继丹[11]的方法进行吞噬率的测定。取肝素抗凝血0.5 mL，大肠杆菌菌液0.1 mL，在1.5 mL离心管中混合均匀后，在30℃的水浴锅内孵育1 h，再离心10 min，吸取血浆与红细胞交界面的白细胞做血涂片，每个血样做2张涂片。自然晾干后，用甲醛固定，姬姆萨染色，置于油镜下观察。随机计数100个白细胞,进行吞噬率的测定。

1.3数据分析

用SPSS13.0软件处理，用单因素方差分析(one-way ANOVA)和 Duncan检验法，当P<0.05时认为差异显著。

2　结果与分析

2.1枇杷多糖对草金鱼血清SOD活力的影响

比如在学习课文的过程中，在课堂上可以安排学生按小组讨论课文的写作背景、作者的感情色彩以及课文的中心思想。在讨论的过程中，教师可以到台下询问情况和指导，然后让每个组就讨论的成果派代表做出发言，教师再对小组讨论的成果进行具体分析和总结，并且给予应有的鼓励。通过这种方式，可以极大提高学生学习的积极性，促使学生进行课前预习，在讨论的过程中学生的语言表达能力以及协作与思维能力也得到了提高。活动促进了学生与学生之间、师生之间的交流沟通和及时反馈实际的问题，这些对提高课堂效率有很大的帮助。

枇杷多糖对草金鱼血清SOD活力的影响见图1，由图1可见，注射0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1枇杷多糖的草金鱼血清SOD活力均显著高于对照组(P<0.05)，各多糖组在0～21 h内随着枇杷多糖浓度的升高，血清SOD活性也升高，在1.0 mg·mL-1、免疫第21 h时，草金鱼血清SOD活力达到最大、为37.8 U，显著高于其他组(P<0.05)。

2.2枇杷多糖对草金鱼血清溶菌酶活力的影响

注射枇杷多糖对草金鱼血清溶菌酶活力的影响见图2，由图2可看出，分别注射0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1的枇杷多糖，在第14～35 h内各多糖组金鱼血清溶菌酶活力均显著高于对照组(P<0.05)，在枇杷多糖1.0 mg·mL-1、免疫21 h后血清溶菌酶的活性最大，达到128 U、显著高于其他多糖组(P<0.05)。在 35～42 h血清溶菌酶的活性呈下降趋势。

2.3枇杷多糖对草金鱼血清酚氧化酶活力的影响

注射枇杷多糖对草金鱼血清酚氧化酶活力的影响见图3，由图3可看出，在一定时间内分别注射0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1的枇杷多糖，随着时间的推移，草金鱼血清酚氧化的活性也随着升高，在枇杷多糖1.5 mg·mL-1、免疫28 h后血清酚氧化酶的活性最大，达到4.1 U。对注射剂量1.0和1.5 mg·mL-1草金鱼血清酚氧化酶活力在0～28 h内呈上升趋势，28 h后血清酚氧化酶的活性呈下降趋势。

2.4枇杷多糖对草金鱼血液白细胞吞噬率的影响

注射枇杷多糖对草金鱼血液白细胞吞噬率的影响见图4，由图4可知注射1.0和1.5 mg·mL-1的枇杷多糖，随着注射含量的升高，白细胞吞噬率也升高，在1.5 mg·mL-1免疫35 h后，草金鱼血液白细胞吞噬率最大，达到55.68%。在7～35 h时白细胞吞噬率呈上升趋势，35 h后白细胞吞噬率呈下降趋势，对于0.5 mg·mL-1组只在第28 h时白细胞吞噬率达到较高水平，但28 h后白细胞吞噬率趋于稳定，2.0 mg·mL-1组的白细胞吞噬率显著低于1.5 mg·mL-1组(P<0.05)。

3　讨论与结论

多糖在细菌、真菌、藻类和高等植物等许多生物普遍存在，由于具有增强免疫力、抗炎症、抗菌、抗辐射、低毒等生物活性而受到人们的极大关注。多糖是重要的免疫增强剂，饲料中添加免疫增强剂能提高鱼类和贝类的免疫力，提高水产养殖的经济效益[1，3，12-13]。莆田市是我国枇杷栽培的主产区，栽培面积占全国的1/3左右，每年有大量的枇杷叶浪费。枇杷叶是枇杷植物中包括枇杷多糖在内许多活性成分的重要来源之一，因此充分利用枇杷叶资源非常必要。

超氧化物歧化酶(SOD)通过清除超氧阴离子而起抗氧化作用。SOD在动物机体免疫中起重要作用，本研究中草金鱼注射枇杷多糖能显著提高草金鱼血清SOD的活力，这与虫草多糖、海藻多糖、浒苔多糖等能显著增强鱼、贝类动物的SOD活性研究结果[14-15]相似。本研究中在枇杷多糖质量浓度1.0 mg·mL-1、免疫第21 h时，草金鱼血清SOD活力达到最大，随着时间推移，SOD值就逐渐降低，可能的原因是免疫活性剂都有发挥作用的有效期，超过其作用的有效期免疫功能就逐渐降低，在本研究中，在溶菌酶、酚氧化酶和白细胞吞噬率指标中都出现类似现象。

溶菌酶是鱼类免疫系统的一个重要部分，它使细菌溶解，并激活补体系统[16]，溶菌酶使病原菌细胞壁肽聚糖的β-1，4糖苷键断裂而溶菌、阻止病原菌繁殖蔓延，溶菌酶升高使鱼类免于受到病原体的入侵[17]。已有研究表明，枸杞多糖、云芝多糖、酵母免疫多糖等能明显提高水产动物的血清溶菌酶活性[16，18-19]。本研究与已有的研究结果相似。

酚氧化酶能氧化机体的酚类物质成醌，醌类可抑制微生物的感染而自我保护，酚氧化酶可以被一些包括β-1，3葡聚糖等多糖激活。已有研究认为，在饲料中添加1 g·kg-1的云芝多糖和虫草菌丝多糖，日本沼虾酚氧化酶活性升高，高于对照组[20]；饲喂12周添加1、2和3%榴莲多糖的对虾血淋巴酚氧化酶活力显著高于对照组(P<0.05)[21]，用添加0.5%羊栖菜多糖(SFPSE)的饲料饲喂对虾，多糖组对虾的血清酚氧化酶活力显著高于对照组(P<0.05)，然而1.0% SFPSE组的血清酚氧化酶活力显著低于对照组(P<0.05)，0.5%和1.0%组对虾肌肉溶菌酶活力极显著高于对照组(P<0.01)，但对照组和2.0% SFPSE组的肌肉溶菌酶活力差异不明显(P>0.05)[22]。在本研究中溶菌酶和白细胞吞噬率指标在高含量多糖组时比较低含量多糖组的指标要低，其可能原因是免疫活性剂在适宜的含量下才能提高动物免疫功能，但高含量时只起抑制作用，因此在使用时要采用适宜含量的多糖，否则会降低动物的免疫力。

吞噬作用是所有动物最常见的防御机制，鱼类的免疫系统与哺乳动物不同，它的非特异性免疫机制是疾病的防御不可或缺的一部分，白细胞吞噬功能具有反映机体非特异性免疫能力的作用,李光友等[23]研究表明脂多糖能显著提高中国对虾血细胞的吞噬作用，人们研究发现对虾血细胞膜上存在有多糖的受体蛋白或结合蛋白，病原体表面的多糖与膜上相应的蛋白作用，增强杀菌作用[24]，本研究也得出枇杷多糖也能显著提高草金鱼白细胞的吞噬作用。

[1]李海芳,常亚青,丁君. 水产动物免疫增强剂的研究现状及应用前景[J]. 水产科学,2004,23(10):35-39.

[2]曹丽萍,丁炜东,张柳,等. 香菇多糖和黄芪多糖对鲤免疫细胞的活性和IL-1β体外诱生表达的影响[J]. 水产学报,2008,32(4):628-635.

[3]王海华,曹义虎,陈长水. 中药免疫增强剂在水产养殖上的应用及免疫药理学研究进展[J]. 中国兽医杂志,2005,41(5):42-44.

[4]何传波,魏好程,熊何健,等. 枇杷叶多糖酶法提取工艺优化及其离子交换层析纯化[J]. 食品科学,2016,37(8):45-50.

[5]朱红林,段国峰. 枇杷叶碱提多糖的分离纯化及组成分析[J]. 南京中医药大学学报,2009,25(4):307-308.

[6]田龙,鲁云风. 枇杷多糖的提取纯化及理化性质初步研究[J]. 中国食品添加剂,2008,(1):88-90.

[7]许申鸿,杭瑚,李运平. 超氧化物歧化酶邻苯三酚测活法的研究及改进[J]. 化学通报,2001,64(8):516-519.

[8]冯惠勇,徐亲民,孙国志. 溶菌酶的生物测定方法研究[J]. 食品与发酵工业,2002,28(4):60-64.

[9]肖婷,刘守柱,薛超彬,等. 紫外分光光度计法与酶标仪微量法测定酚氧化酶蛋白含量及活力的比较[J]. 昆虫知识,2008,45(2):306-309.

[10]王建国,陆宏达. 酚氧化酶活力测定方法中关于测定时间的研究[J]. 上海海洋大学学报,2009,18(6):765-770.

[11]叶继丹,卢彤岩,刘红柏,等. 喹乙醇对鲤的消化酶活性及白细胞吞噬功能的影响[J]. 大连水产学院学报,2004,19(3):161-166.

[12]林旋,张伟妮,王寿昆,等. 黄芪多糖饲料添加剂对罗非鱼白细胞吞噬能力和免疫器官指数的影响[J]. 福建农业学报,2012,27(1):27-31.

[13]李超,张其中,朱成科,等. 增强草鱼免疫功能的复方中草药免疫增强剂筛选[J]. 西南师范大学学报：自然科学版,2012,37(4):121-129.

[14]牟海津,江晓路,刘树青,等. 免疫多糖对栉孔扇贝酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性的影响[J]. 青岛海洋大学学报：自然科学版,1999,29(3):124-129.

[15]徐大伦,黄晓春,欧昌荣,等. 浒苔多糖对扇贝SOD酶和溶菌酶活力的影响[J]. 水利渔业,2005,26(3):22-23，64.

[16]龚全,许国焕,付天玺,等. 云芝多糖对奥尼罗非鱼生长、血清溶菌酶活性和补体活性的影响[J]. 淡水渔业,2008,38(1):16-19.

[17]HARIKRISHNAN R, BALASUNDARAM C, HEO M S. Effect of probiotics enriched diet on Paralichthys olivaceus infected with lymphocystis disease virus (LCDV)[J]. Fish Shellfish Immunology，2010，29:868-874.

[18]陈昌福,杨凡,聂琴,等. 酵母免疫多糖对俄罗斯鲟白细胞吞噬活性和溶菌酶活性的影响[J]. 中国饲料,2014,(21):42-44.

[19]王远吉. 枸杞多糖对鲫鱼血清溶菌酶活性的影响[J]. 中国饲料,2004,(24):28-31.

[20]CHANG M,CHEN X. Effect of two kinds of polysaccharide on the phenoloxidase activity inmacrobrachiumnipponensis[J]. Acta hydrobiologica sinica,2003,27,269-272.

[21]KOMSIL PHOLDAENG, SUNANTA PONGSAMART.Studies on the immunomodulatory effect of polysaccharide gel extracted fromDuriozibethinusinPenaeusmonodonshrimp againstVibrioharveyiand WSSV [J]. Fish Shellfish Immunology，2010, 28: 555-561.

[22]XUXION HUANG，HONGQI ZHOU, HUI ZHANG. The effect ofSargassumfusiformepolysaccharide extracts on vibriosis resistance and immune activity of the shrimp,Fenneropenaeuschinensis[J].Fish Shellfish Immunology,2006,20(5):750-757.

[23]李光友,王青.中国对虾血细胞及其免疫研究[J].海洋与湖沼,1995,26(6): 591- 596.

[24]CHENG W,LIU C H,TSAI C H,et al. Molecular cloning and characterization of a pattern recognition molecule,lipopo—lysaccharide and β-1,3-glucan binding protein ( LGBP ) from the white shrimpLitopenaeusvannamei[J]. Fish Shellfish Immunology, 2005,18: 297-310.

(责任编辑：翁志辉)

Effect of Loquat Polysaccharide on the Immunity ofCarassiusauratus

LIU Cheng-rong1,2

(1.CollegeofEnvironmentalandBiologicalEngineering，PutianUniversity,Putian,Fujian351100,China；2.FujianProvincialKeyLaboratoryofEcologyToxicologicalEffects&ControlforEmergingContaminantsPutian,Fujian351100,China)

The study on the effect of loquat polysaccharides on the immunity ofCarassiusauratuscould provide some evidences for controlling the disease of aquatic animal and making full use of resources of loquat. Therefore, taking theCarassiusauratusas testing material, theCarassiusauratuswas immune by being injected with loquat polysaccharides, in order to study the effect of loquat polysaccharides on superoxide dismutase, lysozyme, phenoloxidase and phagocytic rate. The results showed that: when theCarassiusauratuswas injected with1.0 mg·mL-1loquat polysaccharide for 21 hours, the blood SOD and lysozyme reached the highest, which were respectively 37.8 U and 128 U; when theCarassiusauratuswas injected with 5 mg·mL-1loquat polysaccharide for 28 hours, the blood phenoloxidase activity and phagocytic rates reached the peak value, which were respectively 4.1 U and 55.68%, showing that the loquat polysaccharides could enhance the immune function ofCarassiusauratus.

loquat；polysaccharide;Carassiusauratus; immunity

2016-02-15初稿；2016-05-14修改稿

刘成荣(1964-)，男，教授，主要从事水产动物病害防治方面研究(E-mail：ptulcr@126.com)

福建省属高校科研专项(JK2013046)

Q 329.2

A

1008-0384(2016)07-694-05

刘成荣.枇杷多糖对草金鱼免疫特性的影响[J].福建农业学报，2016，31(7)：694-698.

LIU C-R.Effect of Loquat Polysaccharide on the Immunity ofCarassiusauratus[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：694-698.