全身垂直振动对去卵巢骨质疏松大鼠胫骨和子宫血管内皮生长因子蛋白表达的影响

司会群　卜淑敏　赵俊勇　文思敏　段晓丽

(首都体育学院，北京　100191)



全身垂直振动对去卵巢骨质疏松大鼠胫骨和子宫血管内皮生长因子蛋白表达的影响

司会群1卜淑敏赵俊勇1文思敏段晓丽

(首都体育学院，北京100191)

目的探讨全身垂直振动对去卵巢骨质疏松大鼠胫骨和子宫血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响。方法采用去除大鼠双侧卵巢建立绝经后骨质疏松大鼠模型。将36只3个月龄雌性健康未孕SD大鼠按体重分层后随机分为假手术组、去卵巢静止组和去卵巢振动组。去卵巢10 w后，对去卵巢振动组进行为期7 w的全身垂直振动训练。振动结束后，用ELISA检测血清VEGF水平，用Western印迹检测胫骨和子宫VEGF蛋白表达的变化。结果各组大鼠血清VEGF水平无显著性差异。去卵巢静止组大鼠子宫和胫骨近端VEGF蛋白表达水平显著低于假手术组(P<0.05)，而去卵巢振动组大鼠子宫和胫骨近端VEGF蛋白表达水平显著高于去卵巢静止组(P<0.05;P<0.01)。结论全身垂直振动训练能上调去卵巢骨质疏松大鼠子宫和胫骨近端VEGF蛋白的表达。

去卵巢大鼠；全身垂直振动；血管内皮生长因子

药物治疗虽然在一定程度上能缓解绝经后骨质疏松(PMOP)的症状，但也会给身体其他系统带来不良反应，甚至还会出现不可耐受的副作用或并发症，如药物过敏、不正常的或大量的子宫出血、子宫内膜增生、乳房胀痛、乳腺肿瘤等，给患者带来极大的痛苦和不便〔1，2〕。运动训练是预防和减缓PMOP的另一方法，并且具有明显的优势。但运动方式的选择很关键，有些运动对治疗PMOP虽好，但易增加患者患骨关节炎、骨骼变形、骨折的危险〔3〕。实验研究发现，全身垂直振动训练可能是一种更自然、更便捷，更安全有效的治疗骨质疏松的方式〔4,5〕，但其机制还不完全清楚。本研究观察全身垂直振动训练对去卵巢骨质疏松大鼠血清以及子宫和胫骨近端血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物与饲养3个月龄健康雌性未孕SD大鼠36只，体重(221g±12)g，由北京维通利华实验动物中心提供并饲养，〔动物合格证号SCXK(京)2011-0039〕。每笼饲养4～5只大鼠，标准啮齿类动物饲料喂养，自由饮水和进食，饲养室温度：22℃～25℃，相对湿度：50%～55%，人工控制12 h光照(7：00～19：00)，12 h黑暗(19：00～次日7：00)交替进行。整个实验过程中，按照实验动物使用的3R(减少、替代、优化)原则给予大鼠人道的关怀。

1.2手术方法与分组适应性喂养大鼠1 w后，称量初始体重，按体重先分层后，再随机分为假手术组12只和去卵巢组24只。两组大鼠均于手术前禁食12～18 h。去卵巢手术在北大医学部动物实验科学部进行，假手术组大鼠保留卵巢，只切除卵巢边与卵巢等大的脂肪组织。大鼠手术后可以饮水，但24 h后方可进食。各组大鼠术后静养10 w，以造去卵巢骨质疏松模型，10 w末，用双能X线骨密度仪检测大鼠胫骨近端在体骨密度，如去卵巢大鼠骨密度值显著低于假手术组就说明造模成功。将去卵巢组大鼠按体重分层，再随机分为去卵巢静止组(12只)和去卵巢振动组(12只)。实验过程中去卵巢静止组有2只大鼠相继死亡，实验最后各组剩余大鼠数目分别为假手术组12只，去卵巢静止组10只，去卵巢振动组12只。

1.3振动方案去卵巢后第11周，去卵巢振动组大鼠先进行1 w的适应性振动训练，每天2次，每次10 min，频率50 Hz，振动加速度3.8 g，振幅0.9 mm。从第12周开始，进行为期7 w的正式振动训练，每天2次，每次15 min，间隔15 min，频率90 Hz，振动加速度3.8 g，振幅0.5 mm，正式振动7 w，所有振动实验均在上午进行。

1.4样品的收集末次振动结束后24～36 h内处死全部大鼠。术前均禁食12 h，称量体重。先腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，后腹主动脉取血处死，血放置4℃冰箱过夜，4℃、3 000 r/min、离心20 min，取上层血清分装，标注后置于-80℃冰箱用于血清VEGF检测。取血后迅速游离子宫、按解剖位置准确游离左、右后肢胫骨，将周围附着的软组织和肌肉剔除干净，将子宫和右后肢胫骨近端置于液氮中冻存待测。

1.5血清VEGF水平检测从室温放置30 min后的铝箔密封袋中取出实验所需板条，标准品孔中各加50 μl不同浓度的标准品。待测样品孔中先加10 μl待测样品，再加40 μl样品稀释液。随后标准品孔和待测样品孔中每孔均加入50 μl辣根过氧化酶标记的检测抗体，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育60 min，弃去液体，在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液后静止1 min后再甩去，再在吸水纸上拍干，如此反复洗板5次，每孔加50 μl底物A、B，37℃避光孵育15 min，每孔再加50 μl终止液，即刻(3 min内)在450 nm波长处测定各孔OD值，保留读数结果并进行统计处理。

1.6Western印迹检测子宫和胫骨VEGF蛋白表达的变化取出各组大鼠子宫和胫骨蛋白提取样本，室温融化后迅速上样，在4℃冰箱中电泳2 h，起始电压80 V，大约40 min后电压调到120 V，电泳结束后，4℃冰箱中以电压80 V转膜2 h，浸入用TBS缓冲液稀释成5%的脱脂牛奶中，室温水平摇床封闭1 h，加1∶400稀释的一抗，4℃冰箱孵育过夜，次日，置水平摇床上室温继续孵育1 h，TBS溶液洗膜4次，10 min/次，加入TBS溶液稀释的马抗鼠IgG/碱磷酶标记，室温孵育2 h，TBS溶液洗膜4次，10 min/次；BCIP/NBT显色，蒸馏水终止显色，利用Quantity One软件对各蛋白条带照片进行扫描，记录灰度值与β-actin灰度值之比，作为该蛋白表达的相对值。

1.7统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析，LSD post-hoc检验或Tamhane post-hoc检验。

2　结　果

2.1体重的变化振动结束后，与假手术组比较，去卵巢静止组大鼠体重显著增加；与去卵巢静止组比较，去卵巢振动组大鼠体重虽没有显著变化，但振动前后体重增加量显著低于去卵巢静止组。结果提示，全身垂直振动训练能显著抑制去卵巢骨质疏松大鼠体重的增长。见表1。

表1　各组大鼠体重的变化±s,g)

与假手术组比较：1)P<0.01；与本组振动前比较：2)P<0.05；与去卵巢静止组比较：3)P<0.01

2.2子宫VEGF蛋白表达的变化Western印迹结果显示，去卵巢静止组大鼠子宫VEGF蛋白表达水平(0.828 7±0.003 6)显著低于假手术组(0.875 4±0.001 2)，而去卵巢振动组大鼠VEGF蛋白表达水平(0.879 9±0.004 1)显著高于去卵巢静止组，结果提示，全身垂直振动训练能促进去卵巢骨质疏松大鼠子宫VEGF蛋白的表达。见图1。

图1　子宫VEGF蛋白的表达水平

2.3胫骨VEGF蛋白表达的变化Western印迹结果显示，去卵巢静止组大鼠VEGF蛋白表达水平(1.978 5±0.053 6)显著低于假手术组(3.459 6±0.045 7)，而去卵巢振动组大鼠VEGF蛋白表达水平(3.758 5±0.045 1)显著高于去卵巢静止组。结果提示，全身垂直振动训练能促进去卵巢骨质疏松大鼠胫骨VEGF蛋白的表达。见图2。

图2　胫骨VEGF蛋白的表达水平

2.4血清VEGF水平的变化假手术组VEGF为(160.645 8±18.443 9)pg/ml,去卵巢静止组为(174.499 6±33.899 4)pg/ml,去卵巢振动组为(161.980 1±23.238 5)mg/ml。3组大鼠血清VEGF水平没有显著性差异，提示全身垂直振动训练对去卵巢骨质疏松大鼠血清VEGF水平无显著影响。

3　讨　论

本实验各组大鼠手术后造模10 w过程中，因自然生长，各组大鼠体重均增加，去卵巢组增加迅速，去卵巢手术10 w时即振动前，体重称量结果显示，与假手术组相比较，去卵巢造成体重显著增加。与去卵巢后体重变化的相关报道〔6〕及我们实验室前期实验结果相吻合，初步表明了去卵巢手术的成功。本文结果表明，全身垂直振动训练能显著缓解由于去除卵巢引起的大鼠体重的增加。此结果与Maddalozzo等〔7〕报道得研究结果类似。此外，本次实验中，去卵巢振动组振动训练后体重依然超过正常大鼠体重，出现此结果的可能原因之一，是全身垂直振动对体重的抑制作用还不能完全抵消去卵巢对大鼠体重的影响，振动后体重依然会升高，只是增长的速度减缓。

VEGF是强有力的血管生成因子，它特异性受体相结合后，产生强大促进血管内皮细胞增殖的作用，引起血管加速生长。本实验结果提示，全身垂直振动训练能有效扭转大鼠因去除卵巢引起的子宫VEGF蛋白表达降低的状况，VEGF强大促血管生成功能使大鼠子宫血管生长加速，促进血流和营养物质的运输和吸收，有利于骨质疏松大鼠子宫功能的改善。

VEGF也是骨生长因子，与骨代谢密切相关，协调着骨细胞分化、骨形成和骨吸收过程〔8,9〕，同时还在维持成骨细胞寿命中起着作用〔10〕。已有实验表明，血管生成在骨量转换发生的耦联中起到了关键作用〔11〕，一方面VEGF作为机体内最强的血管生长因子，通过血管化来参与骨的发育和形成，另一方面，VEGF也直接参与成骨和破骨的作用〔12〕，被看作骨代谢因子。多种生长因子可促进VEGF的分泌，VEGF可能是某些骨生长因子发挥作用的中介。VEGF也能直接作用于成骨细胞，促进成骨细胞的增殖和分化，使局部成骨细胞数量增加，加速骨的形成，而成骨细胞也能够产生旁分泌因子来影响血管内皮细胞的功能。本实验结果发现，去卵巢导致VEGF蛋白表达降低。此结果与Kodama等〔13〕实验结果相同。本实验结果与李磊〔14〕报道得结果相似，说明机械振动不仅能增加去卵巢骨质疏松大鼠胫骨VEGF蛋白的表达，而且能促进去卵巢骨折大鼠VEGF蛋白的表达。可见VEGF可能是振动促进骨形成的一种有效刺激信号。全身垂直振动训练能上调去卵巢骨质疏松大鼠子宫和胫骨近端VEGF蛋白的表达水平。

1Sipos W,Pietschmann P,Rauner M,etal.Pathophysiology of osteoporosis〔J〕.Wien Med Wochenschr,2009;159(9-10):230-4.

2Rossouw JE,Prentice RL,Manson JE,etal.Postmenopausal hormone therapy and risk of cardiovascular disease by age and years since menopause〔J〕.JAMA,2007;297(13):1465-77.

3范刚.影响骨质疏松症治疗效果的运动因素〔J〕.太原职业技术学院学报,2008;89(12):157-8.

4Pigozzi F,Rizzo M,Giombini A,etal.Bone mineral density and sport:effect of physical activity 〔J〕.Sports Med Phys Fitness,2009;49(2):177-83.

5Chmitt NM,Schmitt J,Doren M.The role of physical activity in the prevention of osteoporosis in postmenopausal women-An update 〔J〕.Maturitas,2009;63(1):34-8.

6Stunes AK,Syversen U.Skeletal effects of the saturated 3-Thia fatty acid tetradecylthioacetic acid in rats 〔J〕.PPAR Res,2011;2011(1):241-62.

7Maddalozzo GF,Iwaniec UT,Turner RT,etal.Whole-body vibration slows the acquisition of fat in mature female rats 〔J〕.Int J Obes(Lond),2008;32(9):1348-54.

8Patrick Ross F,Angela MC.Nothing but skin and bone 〔J〕.Clin Invest,2006;15:116.

9Zhang Q,Guo R.VEGF-C a lymphatic growth factor is a RANKL target an autocrine mechanism〔J〕.J Biol Chem,2008;283(19):13491-9.

10Street J,Lenehan B.Vascular endothelial growth factor regulates osteoblast survival-evidence for an autocrine feedback mechanism 〔J〕.J Orthop Surg Res,2009;4(1):19.

11Zelzer E,McLean W,Ng YS,etal.Skeletal defects in VEGF(120/120)mice reveal multiple roles for VEGF in skeletogenesis 〔J〕.Development,2002;129(8):1893-904.

12Roy H,Bharlwaj S，Yla-herttuala S,etal.Biology of vascular endothelial growth factors 〔J〕.FEBS Lett,2006;580(12):2879-87.

13Kodama I,Niida S,Sanada M,etal.Estrogen regulates the production of VEGF for osteoclast formation and activity in op/op mice 〔J〕.J Bone Mineral Res,2004;2(19):200.

14李磊.机械振动协同骨髓干细胞动员对大鼠闭合性骨折愈合血管生成的影响及其可能机制〔D〕.西安：陕西师范大学,2012:6.

〔2015-02-09修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

北京市市属高等院校长城学者项目资助(CIT&TCD20130337)

卜淑敏(1967-)，女，教授，博士，硕士生导师，主要从事运动医学研究。

司会群(1974-)，女，硕士，中学一级教师，主要从事运动医学研究。

R338

A

1005-9202(2016)18-4423-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.009

1冀州市职业技术教育中心