老年大鼠慢性压迫性脊髓损伤后病理学变化与重要分子Shh mRNA的相关性

解锦鼎　安　宁　杨晓帆　曹文慧

(牡丹江林业中心医院骨科，黑龙江　牡丹江　157000)



老年大鼠慢性压迫性脊髓损伤后病理学变化与重要分子Shh mRNA的相关性

解锦鼎安宁1杨晓帆1曹文慧1

(牡丹江林业中心医院骨科，黑龙江牡丹江157000)

目的探讨老年大鼠慢性压迫性脊髓损伤后病理学变化与重要分子Shh mRNA的相关性。方法60只大鼠随机分为慢性脊髓压迫组(n=50)和对照组(n=10)，对照组椎板钻孔，慢性脊髓压迫组腹腔内麻醉，比较两组脊髓损伤后不同时间点改良Tarlov评分及斜扳试验变化、脊髓损伤后4 w病理组织学改变、脊髓损伤后Shh mRNA在距损伤区不同距离处表达。结果慢性脊髓压迫组脊髓损伤后1、3 d、1、2、4 w的改良Tarlov评分均显著低于对照组(P<0.05)，3 d、1、2、4 w的斜扳试验也均显著低于对照组(P<0.05)；慢性脊髓压迫组灰质和白质细胞中Shh mRNA表达及分布范围均显著高于室管膜细胞(P<0.05)。结论老年大鼠慢性压迫性脊髓损伤会激活重要分子Shh mRNA表达，进而对神经细胞再生产生重要作用。

慢性压迫性脊髓损伤；重要分子Shh mRNA

现阶段，临床还很少有相关医学学者有效研究神经细胞再生在中枢神经系统损伤后的分子机制，特别是老年大鼠脊髓损伤后。本研究探讨了老年大鼠慢性压迫性脊髓损伤后与重要分子Shh mRNA的相关性。

1　材料与方法

1.1材料兰州大学医学实验中心的60只1月龄雌雄Wistar大鼠，体质量300～350 g，平均(325.3±25.4)g。购买北京中山公司生产的Shh抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、髓鞘碱性蛋白(MBP)及小鼠单克隆抗Shh、兔多克隆抗NSE、GFAP、MBP，工作浓度为1∶100。购买美国Sigma公司生产的Sigma Scan Pro 5.0图像分析系统。

1.2动物模型的制作和分组随机将60只大鼠分为慢性脊髓压迫组(n=50)和对照组(n=10)两组，给予对照组椎板钻孔，给予慢性脊髓压迫组腹腔内麻醉，采用10 g/L 40 mg/kg戊巴比妥钠，常规消毒铺巾，后正中切口切除T12棘突，椎板钻孔，向T12椎板旋入塑料螺钉，直径和螺距分别为3 mm和0.5 mm，定期将螺钉显露出来，每3～5 d 1次，旋入螺钉0.25 mm，分别在1、3 d、1、2、4 w对侧位X线片进行摄取，对椎管侵占率进行观察，到4 w使一半脊髓受压，完成压迫后1、3 d、1、2、4 w分别随机取材，每次5只。

1.3行为学检查压迫后1、3 d、1、2、4 w分别称大鼠体重并进行行为学检查，采用改良斜板试验及Tarlov评分有效检测大鼠行为及肢体运动功能，观察大鼠伤后各时点后肢活动及肌力，从而对大鼠压迫后的运动功能恢复情况进行有效评定〔1～3〕。

1.4病理标本制备在各时相点对慢性脊髓压迫组大鼠、在损伤后4 w对照组大鼠进行腹腔麻醉，采用10 g/L、40 mg/kg戊巴比妥钠，经左心室插管后将右心耳剪开，然后进行灌洗，灌洗过程中采用pH值为7.4的400 ml 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，待流出清亮的液体后进行灌注固定，灌注固定过程中采用pH值为7.4的40 g/L 0.1 mol/L PBS，30 min后将脊髓标本切取下来，该脊髓标本的长度为2 cm左右，中心为伤段，进行30 min的固定，固定环境为40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L PBS，然后将200 g/L蔗糖溶液加入到pH值为7.4的40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/LPBS中，进行1 d的固定，包裹，包裹过程中用锡纸，然后将其在-70℃的冰箱中冷冻，将其有效保存进行HE染色及原位杂交〔4～6〕。

1.5免疫组化荧光技术检测采用PBS进行3次漂洗，每次5 min，对细胞进行破膜，破膜应用Triton X-100，进行10～15 min的封闭，封闭应用BSA，一抗在4℃的温度下进行2 d的孵育，用PBS进行3次漂洗，每次5 min；荧光二抗异硫氰酸荧光素(FITC)在4℃的温度下孵育，过夜，用PBS进行3次冲洗，每次5 min；在37℃的温度下对浓HCl溶液进行30 min DNA变性，用pH值为8.5的硼酸溶液在4℃的温度下进行10 min的缓冲，用PBS进行3次冲洗，每次5 min。一抗在4℃的温度下进行2 d的孵育，用PBS进行3次冲洗，每次5 min；荧光二抗四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)在4℃的温度下孵育，过夜，进行3次冲洗，冲洗过程中用PBS，每次5 min。封片采用甘油缓冲液(PBS∶甘油=1∶1)，对免疫荧光染色神经细胞进行检测，检测运用平面共聚焦显微镜〔7～9〕。

1.6原位杂交检测扩增并抽取纯化质粒，有效标记检测探针DNA，运用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统有效分析Shh mRNA原位杂交图像。将视野中的阳性反应细胞随机选取出来并对其进行半定量分析。其中高信号()具有较为强烈的信号表达，在灰质和白质中大量密集地分布；中等信号()具有显著可见的信号表达，在灰质和白质中大量分布；低信号(+)具有较淡的表达，在灰质和白质中散在分布〔10～12〕。

1.7统计学方法采用SPSS20.0统计软件进行t检验。

2　结　果

2.1两组不同时间点改良Tarlov评分及斜扳试验变化比较慢性脊髓压迫组脊髓损伤后1、3 d、1、2、4 w改良Tarlov评分均显著低于对照组(P<0.05)，3 d、1、2、4 w斜扳试验也均显著低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1　两组不同时间点改良Tarlov评分及斜扳试验变化情况比较±s)

与对照组比较:1)P<0.05

2.2两组4 w病理组织学改变慢性脊髓压迫组压迫后4 w镜下见有卫星现象，脊髓灰质显著水肿，无尼氏小体，具有显著的噬神经元现象，白纸轴突周围具有较大的间隙，轴突纤维具有较为紊乱的排列结构，具有显著的变性水肿，片状脱髓鞘区是其主要表现，且不规则，有空泡样改变，炎性细胞浸润及灶性出血坏死区显著；见图1。对照组脊髓结构破坏不显著。

图1　慢性脊髓压迫组28 d脊髓组织(HE，×400)

2.3两组Shh mRNA在距损伤区不同距离处的表达慢性脊髓压迫组脊髓损伤后1 d具有较低的Shh mRNA表达，脊髓灰质是其表达的唯一场所；损伤后3 d损伤区远端10 mm处具有最弱的Shh mRNA表达；损伤后1、2、4 w损伤区远端10 mm处灰质和白质中均具有较高Shh mRNA表达。NSE阳性神经元细胞在所有时间点灰质中均很少出现Shh mRNA表达阳性细胞，白质中Shh mRNA阳性仅表达于MBP阳性少突胶质细胞中。Shh mRNA表达在GFAP阳性星型胶质细胞中呈阴性。灰质和白质细胞中Shh mRNA表达及分布范围均显著高于室管膜细胞(P<0.05)，损伤区周围5 mm范围内是其在室管膜区域的唯一表达场合，见表2；对照组无Shh mRNA表达，损伤区远端1～10 mm处Shh mRNA阳性细胞分布强度均相似。

表2　慢性脊髓压迫组Shh mRNA在距损伤区不同距离处的表达(n=50)

3　讨　论

Shh参与体内多种发育过程,包括神经管定型、肢体发育、细胞表型定向诱导等。在神经系统发育中,Shh信号通路的主要作用为诱导整个中枢神经系统形成背腹两侧分区,当这一信号通路受到破坏时,将导致整个中枢神经系统腹侧表型神经元完全丧失。Shh在脊髓腹侧神经干细胞分化过程中也是一个非常重要的分子,在胚胎期的脊髓,Shh控制着神经细胞的增殖和分化,决定着细胞命运〔11〕。Shh的功能受体在神经干细胞中高度表达〔12〕,提示Shh信号分子对神经干细胞的增殖与分化起重要作用。Shh信号分子可以维持大脑中神经干细胞生存的微环境。本研究结果说明老年大鼠慢性压迫性脊髓损伤会激活重要分子Shh mRNA表达，进而对神经细胞再生产生重要作用。

1杨亚林.紫杉醇对大鼠慢性脊髓损伤后胶质细胞的影响及其机制研究〔D〕.天津：天津医科大学，2013.

2王凯.大鼠脊髓不同部位慢性压迫病理变化的比较研究〔D〕.天津：天津医科大学，2011.

3温世锋.3.0T MRI高信号DTI定量变化对脊髓型颈椎病转归的预测及其相应的病理机制〔D〕.广州：南方医科大学，2013.

4王培鑫.MRI信号比值与神经细胞凋亡相关性的研究〔D〕.石家庄：河北医科大学，2012.

5宗会迁.颈髓压迫性损伤的磁共振扩散张量成像实验和临床研究〔D〕.石家庄：河北医科大学，2010.

6李利军，宋洁富，魏杰，等.慢性压迫性脊髓损伤后骨骼肌形态学及相关蛋白Myogenin和myoD表达的实验研究〔J〕.中华临床医师杂志(电子版)，2010；4(9)：1691-4.

7李延宏，杨同群，王秉义，等.慢性脊髓损伤后caspase3及凋亡细胞的研究〔J〕.甘肃医药，2013；32(3)：161-3.

8袁凤祥，安春厚.构建脊髓慢性压迫损伤模型大鼠巢蛋白的表达规律〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2011；15(37)：6866-70.

9王岩峰，秦光华，杨明超，等.LY-294002对大鼠急性脊髓损伤后Bcl-2表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(7)：1566-8.

10田小磊，王坤，靳安民.内质网应激相关蛋白在大鼠急性脊髓损伤中的表达及其意义〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(20)：5796-8.

11Long HQ，Xie WH，Chen WL，etal.Value of Micro-CT for monitoring spinal microvascular changes after chronic spinal cord compression〔J〕.IJMS，2014；15 (7)：12061-73.

12Ruiz Picazo D，Ramírez Villaescusa J，Portero Martínez E，etal.Late collapse osteoporotic vertebral fracture in an elderly patient with neurological compromise〔J〕.Eur Spine J，2014；23(12)：2696-702.

〔2015-12-31修回〕

(编辑苑云杰)

安宁(1983-)，女，硕士，主治医师，主要从事神经病学研究。

解锦鼎(1982-)，男，硕士，主治医师，主要从事脊髓损伤研究。

R3

A

1005-9202(2016)18-4440-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.016

1牡丹江医学院红旗医院神经内科