核转录因子-κBp65在口腔扁平苔藓及口腔鳞癌中的表达水平

李　成　张　庆　张艺林　赵桂治　李国凯　乔　慧　漆　明

(宁夏回族自治区人民医院口腔科，宁夏　银川　750004)



核转录因子-κBp65在口腔扁平苔藓及口腔鳞癌中的表达水平

李成张庆1张艺林赵桂治李国凯乔慧2漆明3

(宁夏回族自治区人民医院口腔科，宁夏银川750004)

目的探讨核转录因子(NF)-κBp65在口腔扁平苔藓及口腔鳞癌中的表达水平。方法采用免疫组化与Western 印迹两种蛋白检测技术相结合的研究方法，检测NF-κBp65在口腔扁平苔藓、口腔鳞癌及口腔正常黏膜组织中的表达水平。结果①NF-κBp65在口腔正常黏膜组、口腔扁平苔藓组、口腔鳞癌组中的表达存在显著差异且逐渐增强(P<0.01)。②NF-κBp65在口腔扁平苔藓组织及口腔鳞癌组织中均存在过度表达，且无显著差异(P=1.00)。结论NF-κBp65在口腔扁平苔藓组织及口腔鳞癌组织中均过度表达，NF-κBp65可能参与介导了癌前状态——口腔扁平苔藓组织转化成口腔鳞癌的过程。

癌前状态；口腔扁平苔藓；核转录因子-κBp65蛋白

口腔扁平苔藓(OLP)具有一定的癌变可能〔1〕。 而核转录因子(NF)-κBp65表达于人体绝大多数细胞中,功能十分广泛介导肿瘤的发生〔2〕。众所周知头颈部的鳞癌部分是由癌前病变恶变而来， NF-κBp65作为一种介导恶性肿瘤发生的重要核因子，是否介导了由口腔扁平苔藓转化为口腔鳞癌的过程，有待进一步研究证实。本研究比较NF-κBp65在正常口腔黏膜、OLPA及口腔鳞癌三种组织中表达的差异性及相关性。

1　资料与方法

1.1一般资料30例OLP组织取自2009年4月至2011年1月宁夏医科大学附属医院口腔科门诊的初诊患者， 男10例，女20例；年龄27～63(平均55)岁。 取材前征得患者同意。纳入标准：经病理检查确诊为OLP的患者，取材前3个月内未接受过非甾体类消炎药治疗及激素治疗且无全身系统性疾病。30例口腔鳞癌取自需住院手术患者，男13例，女17例；年龄36～68(平均57)岁。纳入标准：患者临床诊断为口腔癌，术中病理检查明确为口腔鳞癌后开始取材。15例正常口腔黏膜取自口腔科门诊实习学生及工作人员自愿捐献，男7例，女8例；年龄21～57(平均26)岁。捐献者无吸烟、饮酒习惯，口腔黏膜无破损、糜烂，所有组织均取自颊黏膜。 上述取材均一式两份：一份送病理检查，石蜡包埋，标本制片，免疫组化检测备用；一份-80℃冻存，Western 印迹技术检测备用。

1.2主要试剂浓缩型鼠抗人NF-κBp65单克隆抗体； PV9000免疫组化试剂盒；DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸；阳性对照片，以上试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3免疫组织化学染色Pv-9000法检测NF-κBp65表达①组织切片5 μm,常规脱蜡至水,蒸馏水洗;②NF-κBp65采用微波抗原修复,PBS洗3 min×3次;③3%过氧化氢,37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性,PBS洗3 min×3次;④一抗(NF-κB，1∶200)37℃孵育2 h,PBS洗3 min×3次;⑤滴加试剂1，37℃孵育20 min，PBS冲洗，3 min×3次;⑥滴加试剂2，37℃孵育30 min，PBS冲洗，3 min×3次;⑦DAB显色液显色5 min，自来水冲洗终止反应;⑧苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗为阴性对照，以试剂盒中已知阳性切片作为阳性对照。免疫组织化学结果判断：NF-κBp65位于胞质和(或)胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应,高倍镜下(×400)每张片随机选5个视野,计数200个细胞/视野。染色强度与背景无明显差别为-,阳性细胞数<30%为+,30%～60%为,≥60%为。

1.4Western印迹技术检测NF-κBp65蛋白表达提取总标本总蛋白，然后BCA法测蛋白浓度，进行Western印迹实验：①洗玻璃；②制胶；③样本的处理及加样；④电泳；⑤转膜；⑥封闭；⑦加一抗；将封闭完毕的硝酸纤维素膜放入平皿中，加入第一抗体(NF-κBp65 1∶200)，或β-actin抗体(1∶300)封口，4℃冰箱过夜，反应完毕，回收反应液，PBS-T洗3次，每次10 min，PBS洗1次，10 min；⑧加二抗：方法如一抗，加入由辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗，稀释浓度1∶5 000，室温下2 h，反应完毕后，PBS-T洗3次，每次10 min，PBS洗1次，10 min，⑨化学发光，显影，定影，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。用凝胶图像分析成像系统进行扫描图片，并以 Bio-Image Analysis System 进行半定量分析，结果以相对光密度值 (ROD)表示。

1.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行秩和检验、等级相关分析及χ2检验。

2　结　果

2.1免疫组织化学法检测不同组织NF-κBp65的表达15例正常口腔黏膜组织3例-，12例+，阳性率80%，染色主要定位于基底层细胞的胞质。30例OLP组织中4例-，15例+，11例,阳性率86.7%，阳性染色主要定位于棘上皮细胞及基底细胞的胞质。30例口腔鳞癌组织中NF-κBp65阳性率100%，其中4例+，15例,11例，阳性染色定位于鳞癌细胞质26例，染色定位于鳞癌细胞核及胞质4例，见图1。NF-κBp65在三种组织中的表达存在显著差异且逐渐增强(P<0.01)，NF-κBp65在OLP与口腔鳞癌间的阳性率比较无显著差异(P=1.000)。见表1。

2.2Western 印迹检测NF-κBp65在不同组织中的表达NF-κBp65 15例正常口腔黏膜组织12例阳性，3例阴性，阳性率80%，30例OLP组织27例阳性，3例阴性，阳性率90%；30例口腔鳞癌组织NF-κBp65的表达均为阳性。三组间NF-κBp65的表达存在显著差异且逐渐增强(P<0.01)，NF-κBp65在OLP与口腔鳞癌两组间的表达比较无显著差异(P=0.043)。见表1，图2。

表1　NF-κBp65在不同组织中表达比较

与正常口腔黏膜组比较：1)P<0.05

图1　免疫组织化学法检测不同组织中NF-κBp65表示(DAB,×200)

M:Marker;1～3：正常口腔黏膜组织：OLP组织、口腔鳞癌组织图2　Western印迹法检测不同组织中NF-κBp65蛋白的表达

3　讨　论

正常情况下NF-κBp65与I-κβ相结合，并且处于无活性状态存在于胞质中，当NF-κBp65被不恰当激活，定位于胞核不能返回胞质时，其功能将异常增高，进而改变细胞正常的信号转导，从而促使细胞癌变〔3，4〕。

肿瘤细胞与正常细胞相比必须具有以下基本的生理改变:①能够自分泌生长信号供自身生长需要;②无视生长抑制信号，持续生长;③具有抗凋亡特性，对化疗药物和放疗不敏感;④具有无限增殖能力;⑤持续的血管增生;⑥肿瘤细胞的组织浸润性生长和转移。研究表明NF-κBp65所激活的靶基因正好介导了上述几个过程〔5,6〕。目前研究表明,NF-κBp65因子的持续活化可作为包括卵巢肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌以及黑色素瘤等多种实体肿瘤的标志〔7〕。

本研究结果提示，NF-κBp65可能参与了口腔正常黏膜组织发展为OLP及口腔鳞癌的病理过程。NF-κBp65通过调节相应基因的转录,促进肿瘤的发生、肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移〔8〕。研究表明：NF-κBp65过度活化与口腔鳞癌发病密切相关，NF-κBp65可能是口腔鳞癌相关的一种癌蛋白,在口腔鳞癌的发生中发挥重要调节作用〔9〕。NF-κBp65通过调节众多基因的转录，从而参与多种生理及病理过程的调节，在免疫反应、促进细胞的增生、降低凋亡、促进血管新生和肿瘤细胞的转移等方面起着重要作用，成为连接慢性炎症和肿瘤发生的重要分子〔10〕。本文结果提示，NF-κBp65在口腔鳞癌与中都存在着高表达，且无显著差异，该因子在OLP中的表大水平达到了口腔鳞癌的水平。因此，我们推测OLP作为口腔疾病中的一种癌前状态，若其一旦发生癌变，NF-κBp65可能起到作用，但具体机制有待进一步研究。

1陈谦明.口腔黏膜病学〔M〕. 第3版.北京：人民卫生出版社，2008：83-5.

2王文举,李鸿钧,孙茂盛.NF-κB与持久炎症及肿瘤发生关系〔J〕.生命的化学,2007;27(3)：197-9.

3Kim JK,Kim Y,Na KM,etal.Gingerol Prevents UVB-induced ROS production and COX-2 expression in vitro and in vivo〔J〕.Free Radic Res,2009;41(5):603-14.

4Yoshimura S,Bondeson J,Brennan FM,etal. Role of NF-κB in antigen presentation and development of regulatory T cells elucidated by treatment of dendritic cells with the proteasome inhibitor PSI 〔J〕.Eur J Immunol,2010;31(6):1883-93.

5Juge N,Mithen RF,Traka M.Molecular basis for chemoprevention by sulforaphane:a comprehensive review〔J〕.Cell Mol Life Sci,2011;64(9):1105-27.

6Rhodus NL,Ho V,Myers S,etal.NF-kappaB dependent cytokines in patients with oral lichen planus (OLP)〔J〕.Dent Res,2010;80(S1) :1569-71.

7Bonizzi G,Karin M.The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity〔J〕.Trends Immunol,2012;25(6):280-8.

8闫慧慧,张波.核因子κB结构及其研究进展〔J〕.国际检验医学杂志,2007;28(5)：445-7.

9Lind DS,Hochwald SN,Malaty J,etal. Nuclear factor-kappaB is upregulated in colorectal cancer 〔J〕.Surgery,2011;130(2):363-9.

10靳风烁，罗军.核转录因子-κB与免疫应答〔J〕.第二军医大学学报,2006;16(11)：657-61.

〔2015-02-12修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

宁夏自然科学基金资助项目(NZ08108)

漆明(1962-)，女，教授，硕士生导师，主要从事口腔黏膜疾病研究。

李成(1978-)，男，主治医师，硕士，主要从事口腔颌面外科研究。

R78

A

1005-9202(2016)18-4502-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.048

1宁夏回族自治区第三人民医院口腔科

2宁夏医科大学统计教研室3宁夏医科大学附属医院口腔科