UVB诱导HaCaT分泌细胞因子对HSF的影响及桃叶珊瑚苷的保护作用△

陈巧云，王业秋，祁永华，李建民，张宁

(黑龙江中医药大学，黑龙江 佳木斯 154007)

UVB诱导HaCaT分泌细胞因子对HSF的影响及桃叶珊瑚苷的保护作用△

陈巧云，王业秋，祁永华，李建民*，张宁

(黑龙江中医药大学，黑龙江 佳木斯 154007)

目的探讨紫外线B波(UVB)诱导HaCaT分泌细胞因子通过旁分泌机制对HSF的影响及桃叶珊瑚苷的保护作用。方法将桃叶珊瑚苷作用于正常及光老化HaCaT细胞，ELISA试剂盒检测IL-6、TNF-α含量，并将各组培养液分别作用于HSF细胞，RT-PCR、Western-Blot检测HSF细胞中MMP-1、MMP-3的mRNA及蛋白表达。结果桃叶珊瑚苷对正常HaCaT细胞分泌IL-6和TNF-α没有显著影响，而对光老化HaCaT分泌IL-6和TNF-α具有显著的抑制作用(P<0.01)，光老化HaCaT培养液使HSF中MMP-1、MMP-3的mRNA和蛋白表达量升高，桃叶珊瑚苷处理组能够明显改善这种作用(P<0.01)。结论桃叶珊瑚苷通过减少炎症细胞因子IL-6、TNF-α分泌来拮抗UV对角质形成细胞的损伤，又可通过抑制旁分泌机制，保护成纤维细胞，抑制MMP-1、MMP-3的过表达，预防光老化。

桃叶珊瑚苷；HaCaT细胞；HSF细胞；光老化

紫外线B波(UVB)诱导表皮角质形成细胞分泌IL-6、TNF-α等细胞因子通过旁分泌机制促进真皮成纤维细胞表达MMPs，引起光老化[1-2]。本课题组前期研究结果发现，1×10-5mol·L-1的桃叶珊瑚苷(aucubin，AU)通过调节IL-6和TNF-α的表达，拮抗UVB对角质形成细胞的损伤，笔者研究桃叶珊瑚苷干预下的光老化角质形成细胞培养液上清对成纤维细胞分泌MMPs的影响，进一步解释桃叶珊瑚苷抗光老化的作用机理。

1 材料与仪器

1.1 材料

人皮肤成纤维细胞HSF(上海艾研生物科技有限公司)，角质形成细胞HaCaT(上海中桥新舟生物科技有限公司)，胎牛血清、DMEM培养液(Thermo Fisher公司)，桃叶珊瑚苷(成都曼思特生物科技有限公司)，PCR扩增试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、目的基因及内参引物[生工生物工程(上海)有限公司]，人肿瘤坏死因子-α试剂盒、人白介素-6试剂盒(上海晶美生物科技有限公司)，目的蛋白一抗MMP-1、MMP-3、内参β-actin、二抗(Santa Cruz Biotechnology)。

1.2 仪器

二氧化碳培养箱HF90型(上海智城分析仪器有限公司)，紫外线辐照计(北京师范大学光电仪器厂)，紫外线光疗仪SS-01B型(Sigma公司)，PCR扩增仪Tprofessional型(德国biometra公司)，电泳仪DYY-10C型(北京市六一仪器厂)，凝胶成像系统ChampGel 5000型、一体式微型化学发光成像仪smart chemill型(北京赛智创业有限公司)。

2 方法

2.1 细胞的体外培养

HSF细胞、HaCaT细胞均在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，37 ℃，5% CO2、饱和湿度下培养。

2.2 分组

2.2.1 HaCaT细胞分组 指数生长期的HaCaT细胞，以每孔1×106个接种于6孔板，随机分为正常对照组：细胞培养24 h后，换不含药DMEM培养液继续培养；UV照射组：细胞培养24 h后参考文献[3]方法以64 mJ·cm-2的UVB照射建立细胞光老化模型，添加正常培养液继续培养；AU处理组：细胞培养24 h后换含1×10-5mol·L-1桃叶珊瑚苷的培养液继续培养；UV+AU处理组：细胞培养24 h后以64 mJ·cm-2的UVB照射，用桃叶珊瑚苷终浓度为1×10-5mol·L-1的DMEM培养液继续培养。第48小时，取细胞和上清液，-20 ℃保存备用。

2.2.2 HSF细胞分组 指数生长期的HSF细胞以每孔5×105个接种于6孔板，24 h后，换2.2.1四组细胞上清液培养24 h。

2.3 ELISA法检测HaCaT细胞IL-6、TNF-α含量

HaCaT细胞给药处理24 h后收集6孔板中各组细胞的上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-6、TNF-α的含量。

2.4 RT-PCR法检测HSF细胞MMP-1、MMP-3 mRNA的表达

指数生长期HSF细胞按照2.2处理。第48小时，用TRIzol提取细胞的总RNA；用第一链cDNA合成试剂盒将总RNA逆转录为cDNA；以cDNA为模板进行PCR扩增，MMP-1引物F 5′- GGAAGGGCAAGGACTCTAT-3′、R 5′-CAGGGTTTC-AGCATCTGGT-3′，MMP-3引物F 5′-GCTGTGC-GTGGCAGTTTGC-3′、R 5′-AGCCTGGAGAATGTGA-GTGGAGT-3。50 μL反应体系，95 ℃变性2 min，95 ℃变性30 s，52 ℃和58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；取扩增产物5 μL进行琼脂糖凝胶电泳(100 V，30 min)，将凝胶放入ChampGel 5000型凝胶成像系统摄像，与内参OD值相比得各处理组的相对含量。

2.5 Western-Blot检测HSF细胞中MMP-1、MMP-3的含量

HSF细胞按照2.2处理，弃去培养液，用4 ℃预冷的PBS液洗涤3次，置冰上加入WIP裂解液150 μL裂解，12 000 g低温离心，取上清液，加上样缓冲液，沸水煮5 min，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；采用半干法将蛋白转印至PVDF膜上；TBST浸湿后室温封闭2 h；一抗4 ℃孵育过夜；TBST震荡洗涤4次，每次5 min；二抗室温孵育2 h；TBST震荡洗涤4次，每次5 min；吸取多余TBST，将ECL发光液滴加在PVDF膜上，确保工作液覆盖整张膜，吸去多余的工作液。将膜放入化学发光成像仪内，曝光照相及图像分析。

3 结果

3.1 对HaCaT细胞分泌IL-6、TNF-α的影响

由表1可以看出，UVB照射后HaCat细胞分泌IL-6、TNF-α的量升高，与正常对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)；AU处理组与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，UV+AU处理组与UV照射组相比，含量降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。

表1 不同处理对HaCaT细胞分泌IL-6、TNF-α的影响

注：与UV照射组比较，*P<0.05，**P<0.01；与正常对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；下同。

3.2 不同处理对HSF细胞MMP-1、MMP-3 mRNA表达的影响

UV照射组与正常对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)；AU处理组与正常对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，UV+AU处理组与UV照射组相比，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，结果见图1、表2。

注：1.正常对照组；2.UV照射组；3.AU处理组；4.UV+AU处理组。图1 各组细胞MMP-1、MMP-3 mRNART-PCR产物电泳图

表2 不同处理对HSF细胞MMP-1、MMP-3 mRNA相对含量的影响

3.3 对HSF细胞MMP-1、MMP-3蛋白表达的影响

由图2和表3得出：UV照射后MMP-1、MMP-3蛋白表达量增加，与正常对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)；AU处理组与正常对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，UV+AU处理组与UV照射组相比，MMP-1、MMP-3蛋白含量降低，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

注：1.正常对照组；2.UV照射组；3.AU处理组；4.UV+AU处理组。图2 各组细胞MMP-1、MMP-3 Western-Blot图

表3 不同处理对HSF细胞MMP-1、MMP-3蛋白相对含量的影响

4 讨论

UVB直接作用的靶部位为皮肤表皮的角质形成细胞，刺激其分泌IL-6、TNF-α等多种细胞因子等[4-5]。这些细胞因子可直接作用于角质形成细胞本身，放大炎症反应，导致角质形成细胞的进一步损伤，也可通过旁分泌机制作用于成纤维细胞，促进真皮成纤维细胞表达MMPS，加速光老化[1]。

本课题组前期实验研究表明1×10-5mol·L-1的AU对UVB损伤的皮肤角质形成细胞具有很好的保护作用，本次实验进一步来验证AU在此浓度下通过旁分泌机制对成纤维细胞的影响。UVB照射使HaCaT细胞分泌IL-6、TNF-α增多(P<0.01)，说明此照射剂量造成了角质形成细胞的损伤，1×10-5mol·L-1的AU处理后，HaCat细胞分泌TNF-α、IL-6的量与空白对照相比差异无统计学意义(P>0.05)，UVB照射HaCat细胞后加1×10-5mol·L-1的AU处理光损伤细胞，IL-6、TNF-α含量与UV照射组相比，分泌量明显减少(P<0.01)，表明1×10-5mol·L-1的AU对正常HaCat细胞无明显毒作用，但对UV损伤的HaCat细胞具有很好的保护作用。

取上述4个处理组的培养液加到处于对数生长期的HSF细胞中，UV照射组MMP-1、MMP-3的mRNA及蛋白的表达量增多，与空白对照相比差异具有统计学意义(P<0.01)，主要原因是因为UV照射组培养液中IL-6、TNF-α含量多，IL-6、TNF-α等细胞因子通过细胞表面细胞因子受体活化MAPK信号通路，促进MMP-1、MMP-3的表达[6]。1×10-5mol·L-1的AU处理组的上清液对HSF细胞分泌MMP-1、MMP-3的量与正常对照组相比无差异，无统计学意义(P>0.05)，说明单纯AU处理，对HSF细胞分泌MMP-1、MMP-3无显著影响，UV+AU处理组的MMP-1、MMP-3与UV照射组相比，含量降低(P<0.05，P<0.01)，说明AU通过减少HaCat细胞分泌IL-6、TNF-α的量，抑制MMP-1、MMP-3过表达。

综上，桃叶珊瑚苷即可通过减少炎症细胞因子IL-6、TNF-α分泌来拮抗UV对角质形成细胞的损伤，又可通过抑制旁分泌机制，保护成纤维细胞，抑制MMP-1、MMP-3的过表达，预防光老化。

[1] Brenneisen P，Sies H，Scharffetter-Kochanek K.Ultraviolet-B irradiation and matrix metalloproteinases：from inductionviasignaling to initial events[J].Ann N Y Acad Sci，2002，23(15)：2059-2076.

[2] 王小勇，毕志刚.IL-1对UVA辐射成纤维细胞基质金属蛋白酶表达的影响机制探讨[J].中国皮肤性病学杂志，2005，19(9)：513-515，529.

[3] 陈巧云，王业秋，张宁.桃叶珊瑚苷对紫外线B波损伤皮肤角质形成细胞的保护作用[J].中国药学杂志，2014，49(7)：554-558.

[4] John D，Stuart J，Alexandra A O，et al.UV radiation and the skin[J].Int J Mol Sci，2013，14(6)：12222-12248.

[5] 刘海亮，包凯帆，江小燕，等.过敏性疾病关键启动因子在人角质形成细胞中表达的适宜刺激方法探索[J].中国药理学通报，2015，31(4)：576-581.

[6] Kim W E，Yang H J，Youn H S，et al.Myricetin inhibits Akt survival signaling and induces Bad-mediated apoptosis in a low dose ultraviolet(UV)-B-irradiated HaCaT human immortalized keratinocytes[J].J Radiat Res，2010，51(3)：285-296.

InfluenceofHaCaTSecretionofCytokinesInducedbyUVBonHSFandProtectiveEffectofAucubin

CHENQiaoyun，WANGYeqiu，QIYonghua，LIJianmin*，ZHANGNing

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Jiamusi154007，China)

Objective：To investigate UVB-induced HaCaT secretion cytokines and the protective effect of the aucubin on HSF through paracrine mechanisms.MethodsThe aucubin was used for normal and photoaging HaCaT cells，IL-6，TNF-α contents were detected by ELISA.The supernatant was applied to HSF cells，MMP-1，MMP-3 mRNA and protein expression was detected in RT-PCR and Western-Blot.ResultsAucubin had no significant effect on content of IL-6 and TNF-αsecreted by normal HaCaT cells，while photoaging HaCaT was significantly inhibited (P<0.01).Photoaging HaCaT medium increased MMP-1，MMP-3 mRNA and protein expression in HSF，aucubin treatment group could significantly inhibited this effect (P<0.01).ConclusionAucubin can protect keratinocytes by reducing the inflammatory cytokines IL-6，TNF-αsecreting，meanwhile inhibiting MMP-1，MMP-3 over expression by the paracrine mechanisms to protect fibroblast cells.

Aucubin；HaCaT cells；HSF cells；photoaging

2016-04-05)

国家自然科学基金(81274035)；黑龙江省应用技术研究与开发计划项目(PC13S15)；黑龙江中医药大学校基金(201309)；黑龙江中医药大学创新人才支持计划项目(2012)；黑龙江中医药大学佳木斯学院基金(2014)

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李建民，教授，研究方向：中药药理；E-mail：ljm_1030@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.006