多指标综合评价优选葶苈生脉方中桂枝、白术提取工艺△

张静宜，张华潭，魏艳婷，白瑞丹，李春花

(1.河北医科大学 研究生学院，河北 石家庄 050017；2.河北中医学院，河北 石家庄 050200；3.河北中医学院 药剂教研室，河北 石家庄 050200；)

·中药工业·

多指标综合评价优选葶苈生脉方中桂枝、白术提取工艺△

张静宜1，2，张华潭1，2，魏艳婷1，2，白瑞丹2，李春花3*

(1.河北医科大学 研究生学院，河北 石家庄 050017；2.河北中医学院，河北 石家庄 050200；3.河北中医学院 药剂教研室，河北 石家庄 050200；)

目的优选葶苈生脉方中桂枝-白术挥发油的最佳提取工艺。方法采用水蒸气蒸馏法提取桂枝、白术挥发油，并用高效液相色谱法对桂皮醛、白术内酯Ⅰ进行含量测定，以收油率、桂皮醛、白术内酯Ⅰ含量的综合评分为指标，通过L9(34)正交试验，考察加水量(倍)、浸泡时间(h)、提取时间(h)三个因素对桂枝、白术挥发油提取工艺的影响。结果桂枝、白术挥发油提取的最佳工艺为10倍量的水，浸泡6 h，提取4 h。结论正交试验法优选的桂枝、白术挥发油的提取工艺合理可靠，可为葶苈生脉方的开发提供依据。

桂枝；白术；挥发油；正交设计；提取工艺；白术内酯Ⅰ；桂皮醛

葶苈生脉方由红参、桂枝、白术、葶苈子等组成，该方是全国名老中医邢月朋治疗充血性心力衰竭(CHF)的经验方，经临床验证能有效缓解症状，改善生活质量。为将葶苈生脉方开发为安全、稳定、有效的中药新制剂，我们探索适于方中桂枝、白术工业生产的参数。桂枝、白术含较多挥发油，且桂枝中桂皮醛有利尿、强心、改善心肌缺血和供氧的作用[1-2]；白术挥发油尤其是白术内酯Ⅰ的健脾、运脾利水的药理作用明显[3]，即二者均为方中治疗气虚血瘀、阳虚水停型充血性心力衰竭(CHF)的有效成分，因此选用桂皮醛和白术内酯Ⅰ的含量作为混合挥发油质量控制的主要指标。

目前，桂枝和白术单味药挥发油提取已有相关研究[4-5]，但对此药对混合挥发油的提取研究未见报道，本文对桂枝-白术挥发油的提取工艺展开探索。由于桂枝挥发油为重油，密度大于1，白术挥发油为轻油，密度小于1，混合提取时，因为出油时间的差异而难以精确分离。所以本文采用正交试验法，优选水蒸气蒸馏法提取桂枝-白术挥发油的最佳工艺条件，旨在合理有效提取挥发油，提高制剂工艺水平[6]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

岛津LC-15C高效液相色谱仪、SPD-15C紫外检测器、岛津LCsolution15C色谱工作站(日本岛津)；电子天平(上海精密科学有限公司)；分析天平(上海精科仪器厂，TG328B型)；粉碎机(永历药机，YF103B型)；调温型电热套(北京科伟永兴仪器有限公司，DZHW型)；台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，TGL-16)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，KQ2200E型)。

1.2 试药

桂枝和白术饮片均购自安国药材市场，经河北中医学院侯芳洁讲师鉴定，符合2010版《中华人民共和国药典》一部相关项下规定；无水硫酸钠(上海万疆生物技术有限公司，批号：Q0382)；甲醇(色谱纯，批号：M8200-4000，美国Tedia company)；乙腈(色谱纯，批号：TEN7949768，美国 Grace公司)；有机系(0.22μm)微孔滤膜；桂皮醛对照品(南京森贝伽生物科技有限公司，批号：110710-200714)；白术内酯Ⅰ对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-14091408)。

2 方法与结果

2.1 HPLC测定桂皮醛的含量

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Wondasil WR-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱，流动相：乙腈-水(40：60)；检测波长：290 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1;进样量：10 μL[7-8]，见图1～2。

图1 桂皮醛对照品溶液高效液相色谱图

图2 样品溶液高效液相色谱图

2.1.2 对照品溶液的制备 取桂皮醛对照品适量，精密测量，置5 mL量瓶中，加适量甲醇，超声10 min，混匀，定容，作为对照品储备液。吸取桂皮醛对照品储备液适量于100 mL量瓶中，甲醇定容，即得质量浓度为0.04 mg·mL-1的桂皮醛对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 按处方中桂枝10 g,白术12 g,取药材6倍量，即桂枝60 g、已粉碎成中粉(四号筛)的白术72 g，置2000 mL圆底烧瓶中，加入8倍量的水，浸泡2 h，水蒸气蒸馏提取3 h。收集桂枝、白术中的挥发油，后将芳香水进行二次蒸馏提取挥发油。将所收集的挥发油在温度为15 ℃、转速3000 r·min-1的条件下离心6 min。用无水硫酸钠干燥，过滤，得白术、桂枝所提混合油。取所提挥发油0.4 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，得供试品溶液。

2.1.4 标准曲线的制备 取2.1.2项桂皮醛对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件，分别进样5、8、10、15、18、 20、25 μL，测定并记录峰面积，并以桂皮醛峰面积为纵坐标(Y)，进样量(μL)为横坐标(X)进行回归，得回归方程：Y=10 752 427 663.551 4X+120 287.606 5(r=0.999 9，n=7)。结果表明，在所确定的色谱条件下，桂皮醛在0.000 2～0.001 0 μL进样量与所测得的峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 取桂皮醛对照品按2.1.1项下色谱条件连续进样6次，进样体积为10 uL，记录色谱图，记录目标峰的峰面积，并计算RSD值。结果RSD值为0.895 3%(n=6)，表明该仪器的精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、10 h注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行检测，记录桂皮醛的峰面积值，计算RSD值。结果桂皮醛峰面积的RSD值为1.468 5%(n=6)，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.1.7 重复性试验 称取同一批桂枝、白术药材(桂枝60 g、白术过四号筛药材72 g)共6份，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件，记录桂皮醛的峰面积，并计算该样品含量的RSD值。结果桂皮醛含量的RSD值为1.886 1%(n=6)，表明该方法重复性较好。

2.1.8 加样回收率试验 精密吸取已知含量的供试品溶液9份，于5 mL量瓶中，3份为一组，加入对照品溶液0.87、1.73、2.60 mL，甲醇定容，测定，计算桂皮醛平均加样回收率为99.63%，RSD值为0.894 2%(n=9)。表明该方法测定桂皮醛的含量准确可靠。

2.2 HPLC测定白术内酯Ⅰ的含量

2.2.1 色谱柱：Wondasil WR-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流动相：甲醇-水(76∶24)；检测波长：220 nm；柱温：30 ℃；流速：0.8 mL·min-1；进样量：20 μL[9]，见图3～4。

图3 白术内酯Ⅰ对照品高效液相色谱图

图4 样品溶液高效液相色谱图

2.2.2 对照品溶液的制备 取白术内酯Ⅰ对照品适量，精密称定，置于5 mL量瓶中，加适量甲醇，超声处理20 min，溶解，定容至刻度，即得质量浓度为0.686 0 mg·mL-1的对照品储备液。

2.2.3 供试品溶液的配制 按照2.1.3项下方法水蒸气蒸馏提取桂枝、白术混合挥发油，取所提混合挥发油0.4 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，即得供试品溶液。

2.2.4 标准曲线的制备 取2.2.2项下对照品溶液，按2.2.1项下色谱条件下，分别进样8、10、15、18、20、25、30 μL，测定峰面积，并以白术内酯Ⅰ峰面积为纵坐标(Y)，对进样量(μg)为横坐标(X)进行回归，得回归方程：Y=393 310.5X-37 259.99(r=0.999 9，n=7)。结果表明，在所确定的色谱条件下，白术内酯Ⅰ在5.448～20.580 μg进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 取白术内酯Ⅰ对照品溶液，按2.2.1项下色谱条件下连续进样6次，进样体积为20 μL，记录色谱图，记录目标峰的峰面积，并计算RSD值。结果RSD值为0.563 7%(n=6)，表明该仪器的精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、10 h进样，测得白术内酯Ⅰ的峰面积值并计算RSD值。结果白术内酯Ⅰ峰面积的RSD值为1.132 4%(n=6)，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 称取同一批桂枝、白术药材(桂枝60 g、白术过四号筛药材72 g)共6份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进行测定，并计算样品溶液含量的RSD值。结果RSD值为0.967 9%(n=6)，表明该方法重复性较好。

2.2.8 加样回收率试验 精密吸取已知含量的供试品溶液9份，3份为一组，于5 mL容量瓶中，加入对照品溶液0.58、1.16、2.32 mL，甲醇定容，测定，计算白术内酯Ⅰ平均加样回收率为98.92%，RSD为2.489%(n=9)。表明该方法测定白术内酯Ⅰ的含量准确可靠。

2.3 正交试验优选桂枝、白术的提取工艺

在预试验的基础上参考相关文献[10-12]，选定加水量(A)、浸泡时间(B)、提取时间(C)为主要影响因素，以收油率、桂皮醛及白术内酯Ⅰ的含量为指标，进行综合评分。综合评分[13]=0.4×挥发油得率/挥发油得率最大值+0.3×桂皮醛含量/桂皮醛含量最大值+0.3×白术内酯Ⅰ含量/白术内酯Ⅰ含量最大值。采用L9(34)安排正交试验，提取工艺的因素与水平见表1，正交试验直观分析结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 提取工艺因素水平表

表2 正交试验结果表

表3 方差分析表

注：F0.01(1，2)=99；F0.05(1，2)=19。

由表2、表3可知，3个因素的影响大小依次为：C>A>B，即：提取时间>加水量>浸泡时间。方差结果表明，提取时间对本次试验有显著性影响。结合正交试验结果最终确定最佳提取工艺：A3B3C1，即：加10倍量的水，浸泡6 h，提取4 h。该工艺符合要求，且提高了工业生产效率，可行性较高。

2.4 提取工艺验证

按最佳工艺提取桂枝-白术药材3份，测定挥发油得率、桂皮醛和白术内酯Ⅰ的含量，见表4。结果表明，验证试验3个指标及综合评分均比正交表中9组试验的值高，说明本次正交试验所筛选的工艺是合理可行。

表4 最佳提取验证试验结果

3 讨论

通过查阅文献[14-15]，对于白术药材提取挥发油的前期处理，仅是单一的将其粉碎为小块状或者粗粉，并未对白术具体粉碎的程度进行筛选。本研究为提高挥发油得率，在预试验中即将白术粉碎为块状、最粗粉、粗粉、中粉、细粉5种规格，水蒸气蒸馏提取挥发油。结果发现，粉碎为中粉提取的挥发油的含量明显高于其他3种规格，而细粉可能由于粉碎过细，造成挥发油部分损失，而且在水蒸气回流过程中有泡沫过多及糊锅现象，挥发油含量并不高。因此确定将白术粉碎为中粉。

在提取挥发油的过程中温度较低时容易发生乳化现象，而适当调高温度时乳化现象消失，因此保证挥发油提取器中液体的流动性是提高挥发油质量的关键因素之一。

桂枝-白术在水蒸气蒸馏提取挥发油过程中，会有一小部分挥发油溶解在热水中，为提高挥发油含量，本试验完成挥发油提取后，继续收集滤液，进行二次蒸馏，并用无水硫酸钠干燥，以减少挥发油成分的损失。

流动相选择：桂皮醛首先确定使用的流动相为乙腈，原设想白术内酯Ⅰ也在该流动相下经反复调节乙腈和水的比例使其出峰、分离，但由于白术挥发油含有多种内酯类成分，且它们的极性较小且相差不大，所以在调节流动相时相对复杂。多次尝试不同流动相，白术内酯Ⅰ前后杂峰均很多，且拖尾现象严重，加0.1%磷酸也未能有所改善善，因此考虑改选甲醇为流动相，反复尝试最终选用甲醇∶水(76∶24)流动相，结果对照品和样品峰的分离度、拖尾因子均符合要求。

本试验根据挥发油得率、桂皮醛含量、白术内酯Ⅰ含量3个指标的重要性，给出相应权重系数。由于三者都是决定挥发油提取效率的关键因素，且挥发油提取的体积越多，有效成分含量越多，所以加权评分中挥发油得率为0.4，桂皮醛和白术内酯Ⅰ含量各为0.3，这样选所提混合挥发油的两种成分不仅比单一成分的含量测定更加合理，而且保证了评价指标的完整和全面；另一方面，由于这3个指标中，挥发油得率的单位与后两者指标的单位不同，且三者原始数据相差较大，因此要对数据进行标准化处理，采用Ci/Cimax，即试验中每组数据除以该组数据的最大值，以消除每组数据差异较大对评分结果的影响。

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OptimizationofExtractionProcessofVolatileOilfromRamulusCinnamomiandAtractylodesRhizomefromTingliShengmaiDecoctionbyMulti-indexOrthogonalTest

ZHANGJingyi1,2，ZHANGHuatan1,2，WEIYanting1,2，BAIRuidan2,LIChunhua3*

(1.Past-graduateSchool，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050017，China；2.HebeiUniversityofTraditionalChineseMedical，Shijiazhuang050200,China；3.DeptofTCM，HebeiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shijiazhuang050200，China)

Objective：To optimize the extraction technology of volatile oil from Atractylodes Rhizome and Ramulus Cinnamomi.MethodsRamulus Cinnamomi and Atractylodes Rhizome volatile oil was extracted by steam distillation.Contents of atractylenolide I and cinnamaldehyde were determined by HPLC.Orthogonal test was adopted to optimize extraction process with composite score of content of volatile oil of Atractylodes Rhizome，cinnamic aldehyde and atractylenolide as index，the amount of water，soaking time and extraction time as factors.ResultsRamulus Cinnamomi and Atractylodes Rhizome volatile oil extraction optimum process is：adding 10 times amount of water，soak 6 hours，extraction for 4 hours.ConclusionThe optimum extraction process of water vapor distillation method is reasonable and reliable for industrial production of Tingli Shengmai decoction.

Ramulus Cinnamomi；Atractylodes Rhizome；volatile oil；orthogonal test；extracted process；atractylenolide I；cinnamaldehyde

2015-11-02)

河北省科技支撑计划项目(15272701D)

*

李春花，教授，研究方向：中药制剂新技术、新方法的研究；E-mail：hbykdxlch@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.021