蒙古族人群中5-脂氧合酶基因E254K多态性的研究

许　涛，王　旭，刘佳玲，冯　雪，吴晓东，史铁伟，白春英

（赤峰学院　医学院，内蒙古　赤峰　024000）

蒙古族人群中5-脂氧合酶基因E254K多态性的研究

许涛，王旭，刘佳玲，冯雪，吴晓东，史铁伟，白春英

（赤峰学院医学院，内蒙古赤峰024000）

本文通过相关实验研究了蒙古族正常人群中5-脂氧合酶E254K多态性分布情况，同时与汉族正常人群中分布情况进行相比，为之后研究该多态性与蒙古族人群中哮喘患者之间的关系奠定了基础.

5-脂氧合酶；E254K多态性；等位基因特异性PCR

1　引言

花生四烯酸在分解代谢体系中十分重要的生物酶，该酶为5-脂氧合酶（5-lipoxygenase 5-LO），白三烯（Leukotrienes LTs）是花生四烯酸的分解代谢后所得到的物质，这种物质多数会诱发人体呼吸道炎症发应、呼吸道支气管痉挛及其呼吸急促等现象，其中白三烯（LTS）的生理活动较为强烈、产生生理作用时间相对比较长，是导致人体引发过敏性支气管哮喘疾病发生的关键性炎症物质.在5-脂氧合酶基因中拥有14个外显因子，该mRNA基因在5-脂氧合酶中整体长度为2568bp，根据参考文献［1-2］中表现出5-脂氧合酶基因多变性和人群内有哮喘疾病的发生相关联，此中cDNA第760位的基因G突变成为A，其中坐落于第六个外显因子上的基因是760G＞A，有关在分子生物基因诊断库中曾有相关记录，与之相对的第254位上的氨基酸中通过其携带有负离子电荷的谷氨酸（E）转变成携带有正离子电荷的赖氨酸（K），该一单核苷酸的多变性（SNP）诱发了离子电荷的变化，影响了5-脂氧合酶的特性或此酶与其他相关酶之间的彼此效用.有研究证明我国汉族人群中5-脂氧合酶基因E254K多态性与哮喘的发生有关，但在蒙古族正常人群中的分布情况还不清楚.该研究的目的在于检测该多态性在蒙古族正常人群中的分布情况，同时与汉族正常人群中的分布情况进行对比，为进一步研究该多态性与蒙古族哮喘患者的关系奠定基础.

2　材料与方法

2.1样本的采集与编号

样本来源于附属医院正常体检的蒙古族人群和在校的蒙古族学生志愿者，采集3毫升外周血，对于收集来的标本进行实名登记和编号.共采集了200名蒙古族正常人群样本.

2.2白细胞的分离及DNA的提取

参考白春英等［3］方法，0.2%NaCL溶液中红细胞易破裂，白细胞不受影响的特点.即3ml全血加0.2%NaCl到10ml，混匀裂解红细胞（2500rpm，5min），弃上清加0.2%Na-Cl混匀进一步裂解未裂解的红细胞（2500rpm，5min）弃上清.最后加 1ml 0.2%NaCl吸打混匀，移入 1.5ml离心管（12000rpm，1min），弃上清，白细胞沉淀-20℃保存之后按提取DNA基因组的操作步骤进行.

2.3引物的设计与PCR反应体系

该研究采用等位基因特异性PCR法（AS-PCR），该方法对引物设计有特殊的要求，可以快速、简便、低成本的检测等位基因单核苷酸多态性.由于Taq DNA聚合酶缺乏3’-5’外切酶的活性，在选择突变型引物扩增正常DNA模板时，野生型引物的碱基与模板无法形成磷酸酯键导致Taq酶无法延伸，检测不到特异长度的条带，从而表明模板DNA无此突变.检测到特异长度的条带，表明该模板为突变型基因组成.如果突变型引物和非突变型引物分别用于扩增同一DNA模板，则对扩增结果判断分析是否有特定位点基因的特定突变［4］.根据这一原理针对野生型和突变型设计3’端的碱基，一般倒数第二位的碱基会设计成故意错配的碱基，可以更好的提高引物的特异性［5］.我们参考文献［6］订购引物：5-LO 254W引物序列（检测Glu）：5’-CgC TgC ACA gAg CTg CCt g-3’；5-LO 254M引物序列（检测Lys）：5`-CgC TgC ACA gAg CTg CCt A-3’；5LOEX6A引物序列（共用的右侧引物）：5’-cgc aat tcc tcc tct gat gt-3’，PCR产物为301bp；设计的内参照用左侧引物为5LO EX8S引物序列：5’aga ggc gaa gtt ctc caa ca；右侧引物为5LO EX8A引物序列（内参照）：5’aac agg gac gga gag tga tg-3’，PCR产物为600bp.

PCR反应体系：分A管和B管，两管中均加入对照用一对引物和共用的下游引物，区别在于每个管子分别加入野生型和突变型的上游引物.反应体系中加入PCR mix：12.5μl；内参照引物5LO EX8S和5LO EX8A（10μM）各1μl；引物5-LO 254W（A管）/5-LO 254M（B管）和5LOEX6A（10μM）各1μl；模板（150-200ng/μl）：1μl；灭菌水；7.5μl，总体系25μl.

PCR反应条件：95℃预变性5min，然后按95℃30sec、56℃30sec、72℃1min，循环35次，末次循环后72℃延伸10min，4℃保存.

2.4琼脂糖凝胶电泳和EB染色

首先量取琼脂（Agar）粉0.75g，小心倒入到锥心瓶中，之后再加入1x TAE稀释后的缓冲溶液40ml；放入微波炉中高温煮至沸腾，摇晃3-4次，取出后等到琼脂溶液冷却至50度-55度之间时（小心琼脂溶液不可以温度过底而出现凝结），再慢慢倾入到制胶膜具和提前插好的梳子中；样品孔应该对应放在阴极端；之后向电泳槽内倒入1xTAE稀释后缓冲溶液，液体的凹液面要略高于胶面2mm左右，打开电源后观察左右端是否有气泡产生，如有则表示电路正常开始跑电泳30分钟.电泳跑完后，小心拿出琼脂凝胶膜将其平移放入到备好EB染色液中暗光浸染30min，在凝胶成像系统（Tocan240）中观察图像并进行数据分析，再将测试图像保留.

3　结果

3.1凝胶电泳结果

取PCR产物10ul，进行2%的琼脂糖凝胶电泳，鉴定PCR扩增的结果，取5ulDNA markerI作为标记，条带分别为600、500、400、300、200、100（bp），见图1.

图1　等位基因特异性PCR法检测5-脂氧合酶E254K电泳结果

第1泳道为markerI，每个样本分A和B两管，A管加的是野生型引物，B管加的是突变型引物.第2和3泳道为一个样本，结果显示为A管和B管除了有内参照物条带外都出现了目的条带，说明是杂合突变型GA.第4和5泳道为一个模板，说明也是杂合突变型GA.第6和7泳道为一个样本，结果显示A管除了有内参照条带外还有目的条带，而B管未出现目的条带说明为野生型GG；第8和9泳道为一个样本，结果显示为野生型GG.

3.2基因频率和基因型频率

该研究共检测了200名蒙古族正常人群的5-LO基因E254K多态性位点，对比课题组之前研究的212名汉族正常人群中该位点的基因频率和基因型频率，见表1.

表1

4　结论

项目组检测5-脂氧合酶E254K多态性在蒙古族正常人群中的分布情况，在200名蒙古族人中检测出6人有该位点的杂合突变，基因型为GA，等位基因G的基因频率为0.985，等位基因A的基因频率为0.015，基因型频率GG为0.97，GA为0.03.与课题组前期212名汉族正常人群中的分布情况进行对比，通过t检验统计分析结果显示p＞0.05，说明该位点在蒙古族正常人群中的分布与汉族正常人群没有显著性的差异.该结果为研究5-LO E254K位点在蒙古族哮喘患者中的分布奠定了基础.

〔1〕Chunying Bai，Eiko Matsui，HidenoriOhnishi，etal.A novelpolymorphism，E254K，in the5-lipoxygenase gene associated with bronchial asthma［J］.International Journal of Molecular Medicine，2008，21：139-144.

〔2〕Bai C，Yu X，Yun R，et al.Association of 5-lipoxygenase gene polymorphisms with bronchialasthma［J］.Exp Ther Med，2012，4（6）：967-971.

〔3〕白春英，周静，瑞云，等.经济、有效提取外周血基因组DNA的方法［J］.检验医学与临床，2010（17）：1795-1798.

〔4〕李春晓，张晓龙，曹晓梅，等.特异性等位基因PCR扩增技术检测家蝇击倒抗性相关钠通道的基因突变［J］.中国媒介生物学及控制杂志，2007，18（3）：255-256.

〔5〕徐克前.分子生物学检验技术实验指导（第二版）［M］.北京：人民卫生出版社，2007：154-158.

〔6〕白春英，史铁伟，瑞云，等.等位基因特异性PCR法检测5-脂氧合酶基因多态性 ［J］.山东医药杂志，2012，52（31）：28-29.

R562.2

A

1673-260X（2016）10-0054-02

2016-06-05

白春英，赤峰学院医学院分子医学研究中心重点实验室