3种ELISA试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的比较

王 翠，方先珍，刘晓丽，程 果

（河南省动物疫病预防控制中心，河南 郑州 450008）

试验研究

3种ELISA试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的比较

王 翠，方先珍，刘晓丽，程 果

（河南省动物疫病预防控制中心，河南 郑州 450008）

为比较猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA试剂盒检测效果，选择LSI、IDE和LSY3种ELISA诊断试剂盒对90份猪血清样品进行检测。结果显示LSI和IDE ELISA试剂盒更能真实地反应猪群实际免疫情况，且LSI的检测结果更为可靠；LSY ELISA试剂盒在实际使用中存在一定的不确定性。LSI ELISA试剂盒更适用于疫苗免疫抗体的检测；IDE ELISA试剂盒更适用于检测机体自然免疫产生的抗体和低日龄猪群免疫抗体。

血清学检验；PRRSV；ELISA试剂盒；包被抗原

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由动脉炎病毒科动脉炎病毒属的猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统损伤及免疫抑制和持续性感染的传染性疾病。以母猪发热、厌食、繁殖障碍，妊娠母猪早产、流产，产死胎、弱胎、木乃伊胎，1周龄仔猪死亡率为40%～80%，1月龄时表现为发热、呼吸困难，个别猪耳部和腹侧皮肤呈一过性紫色，并且发育不良，运动障碍，免疫力严重降低，易继发感染等为主要特征。

目前使用疫苗对猪群进行免疫是预防该病的主要方法。迄今国内有多种方法可用于PRRSV血清抗体检测。笔者选择了3家基于ELISA方法建立的诊断试剂盒对90份猪血清样品进行比对试验，以期发现更好的诊断试剂盒用于临床样品检测。

1 材料与方法

1.1 样品

样品来自免疫背景清楚的规模养殖场，共计90份血清，其中育肥猪、仔猪、母猪各30份。

1.2 主要试剂与仪器

法国LSI公司猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，以下简称为LSI；美国IDEXX公司PRRSX3 Ab试剂盒，以下简称为IDE；深圳市绿诗源生物科技有限公司PRRS（IgG）诊断试剂盒，以下简称为LSY。所用检测试剂均在有效期内。

酶标仪，购自美国BIO-TEK公司，型号ELX-800；自动酶标洗板机，购自美国BIO-TEK公司，型号ELX-50；恒温箱，购自上海跃进医疗器械厂。

1.3 试验方法

试验中使用到的试剂盒其方法均是间接ELISA，具体操作均严格按说明书所述进行。

2 结果与分析

2.1 检测结果

试验中使用LSI、IDE、LSY 3种试剂盒对90份猪血清样品进行检测，其检测结果均严格按使用说明书所述进行阴阳性判定，具体如表1。

2.2 3种试剂盒检测结果值的相关性

检测数据使用EXCEL处理，采用相关系数、符合率、Kappa统计量进行统计分析。

Kappa统计量的一致性强度按照参考文献［1］的方法进行，Kappa值愈高表示一致性愈好。Kappa值＜0时，表明两方法间一致性为极差；Kappa值在0.0～0.2范围内，一致性为微弱；Kappa值在0.21～0.40范围内，一致性为弱；Kappa值在0.41～0.6范围内，一致性为中度；Kappa值在0.61～0.80范围内，一致性为高度；Kappa值在0.81～1.00范围内，一致性为极强。

表1 3种试剂盒的检测结果

对LSI、IDE、LSY 3种试剂盒的检测结果进行相关性分析，根据相关系数检验表查出，LSI与IDE试剂盒有极显著的相关关系（P＜0.01），LSY与LSI试剂盒的相关关系不显著（P＞0.05），LSY与IDE试剂盒的相关关系显著（0.01＜P＜0.05），具体相关系数如表2。

表2 3种试剂盒检测结果的相关系数

2.3 3种试剂盒检测结果的一致性

符合率指2种检测结果定性同时为阳性或阴性样本数之和除以检测总数。IDE与LSI检测结果符合率为57.78%（表3），其一致性强度为弱。这两种试剂盒检测结果中育肥猪的符合率为93.33%，仔猪的符合率为50%，母猪的符合率为30%。

表3 IDE与LSI检测结果一致性分析

LSY与LSI检测结果符合率为43.33%（表4），其一致性强度为微弱。这两种试剂盒检测结果中育肥猪的符合率为3.33%，仔猪的符合率为53.33%，母猪的符合率为73.33%。

表4 LSY与LSI检测结果一致性分析

LSY与IDE检测结果符合率为33.76%（表5），其一致性强度为极差，这两种试剂盒检测结果中育肥猪的符合率为10%，仔猪的符合率为96.67%，母猪的符合率为56.67%。

2.4 不同种群的抗体消长规律

3种检测试剂盒对仔猪、育肥猪、母猪血清中抗体检测结果见下图，仔猪、育肥猪、母猪血清中检测到的抗体阳性率基本呈递增趋势，对不同日龄群体的免疫程序能反映出其相关性，但不同试剂盒有差异，特别是LSY试剂盒的

表5 LSY与IDE检测结果一致性分析

检测结果与另外两种试剂盒差异显著。

图 不同日龄种群免疫抗体阳性率检测结果

3 讨论

3.1 ELISA试剂盒抗原包被的差异

试验中使用的3种ELISA试剂盒均是通过间接ELISA方法检测猪血清中的PRRSV IgG抗体。其中试剂盒所包被的PRRSV抗原不同：LSI，IDE试剂盒以N核衣壳蛋白（N蛋白）作为主要的包被抗原，LSI试剂盒以膜蛋白（M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5）作为主要包被抗原。

N蛋白是PRRSV病毒粒子中含量最高的结构蛋白，占病毒蛋白的20%～40%，是含有一个潜在的糖基化位点的磷酸化蛋白，作为主要的结构蛋白之一，保守性高，具有群特异性，能够同时用于检测欧洲株和美洲株［2］。N蛋白激发的免疫反应最强，机体产生的PRRSV抗体主要是针对N蛋白。此外，猪感染PRRSV 1 w后即可检出N蛋白抗体，且N蛋白抗体维持时间较长。因此N蛋白可作为良好的诊断抗原来检测PRRSV，也是最早用于试剂盒研究的蛋白。但是，N蛋白不能诱导机体产生病毒中和抗体，仅以N蛋白作为包被抗原的试剂无法反映机体的免疫状态，不适合用于对疫苗免疫效果监测。

M蛋白是ORF6编码的非糖基化膜蛋白，也是PRRSV的主要结构蛋白之一。其刺激机体引起的T细胞增殖反应最强。Gp5是ORF5编码囊膜糖蛋白，能诱导高滴度的中和性抗体，Gp2，Gp3，Gp4也各有相应的生物学特性［3］，如参与细胞免疫和体液免疫，诱导产生主要的中和性抗体。因而，采用膜蛋白作抗原的诊断试剂盒不仅能检测野毒感染状况，而且能解决N蛋白作为抗原的诊断试剂盒无法反映机体免疫状况的缺陷，有利于疫苗抗体水平的检测。

因此，IDE试剂盒理论上适用于检测机体自然免疫产生的抗体；LSI试剂盒更适用于疫苗抗体水平的检测。

3.2 3种试剂盒检测结果差异分析

通过对试验结果的分析，笔者发现这3种ELISA检测试剂盒中IDE与LSI的差异相对较小，而LSY不论是总体结果还是针对不同群体的检测结果，均与IDE和LSI差异较大，而且与猪群的实际免疫情况亦不相符。究其原因，除了上述包被抗原的差异外，还可能与试剂盒生产过程中抗原的存储、稳定性以及显色系统的稳定性等具体制作工艺有关。

结合猪场的具体免疫情况（仔猪、育肥猪、母猪分别经1次、2次、4次免疫）以及免疫抗体的消长规律［4］，笔者发现IDE和LSI2种试剂盒更能准确和真实地反应猪群的实际免疫情况，且LSI产品的检测结果更为可靠，更适用于实际生产中疫苗抗体水平的检测。同时综合3种试剂盒的一致性结果可知，IDE试剂盒检测低日龄猪抗体时与LSI结果符合率高，对母猪血清中的抗体水平检测结果与LSI的符合率低，可能与母猪生长过程中PRRSV感染毒株和两种试剂盒所包被抗原不同有关，因此在实际应用中更适用于检测低日龄猪群免疫抗体水平。4 结论

猪PRRSV ELISA检测试剂盒在实际应用过程中还应该结合猪群的具体免疫背景、猪群日龄、健康状况以及相应的病原学检测结果等，才能更好地为生产服务。

［1］夏邦世，吴金华.Kappa一致性检验在检验医学研究中的应用［J］.中华检验医学杂志，2006，29（1）：83-84.

［2］张林吉.猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白原核表达及抗体间接ELISA检测方法的初步建立［D］.扬州大学大学硕士论文，2007.

［3］周婷.猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及M蛋白基因克隆与序列分析［D］.四川农业大学硕士论文，2005.

［4］姚敬明，孟帆，吴忻，等.猪繁殖与呼吸综合征母源抗体和免疫抗体的消长规律研究［J］.中国畜牧兽医，2010（4）：205-209.

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1004-5090（2016）09-0008-03

2016-08-16）