鹅颗粒细胞转录因子GATA结合蛋白4（GATA4）真核表达质粒的构建

袁 鑫，夏 露，孙文强，王继文，*

（1.四川农业大学，四川 成都　625014； 2.成都农业科技职业学院，四川 成都　611130）

鹅颗粒细胞转录因子GATA结合蛋白4（GATA4）真核表达质粒的构建

袁 鑫1，2*，夏 露1，孙文强1，王继文1，*

（1.四川农业大学，四川 成都625014； 2.成都农业科技职业学院，四川 成都611130）

【目的】本研究旨在构建鹅颗粒细胞转录因子GATA结合蛋白4（GATA4）绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1/GATA4，为研究GATA4在鹅颗粒细胞中功能作用奠定实验基础。【方法】原代培养鹅颗粒细胞，取细胞总RNA，RT-PCR扩增出GATA4 cDNA基因片段，克隆连接至载体PMD19-T，用限制性内切酶EcoRI及BanHI酶切，鉴定克隆产物为所需的目的基因片段后，胶回收目的基因，并进行序列测定，然后将上述胶回收产物与载体pEGFP-N1连接，导入感受态DH5α，菌液涂于含卡那霉素琼脂糖平板上，挑取抗性单菌落，进行质粒DNA扩增，酶切及测序鉴定，证实均为阳性克隆，即GATA4与pEGFP-N1体外重组成功。【结论】采用体外重组技术，成功将鹅GATA4 cDNA插入荧光蛋白表达载体pEGFP-N1中。

GATA4；真核表达载体；质粒pEGFP-N1；克隆

GATA家族能与核酸共同序列（A/T）GATA（A/G）相结合的一类转录因子，包括6个成员，即GATA1、2、3、4、5和6。其中，只有GATA4和GATA6在卵巢颗粒细胞中共同表达，GATA4与小鼠、猪、人等的卵巢颗粒细胞分化、增殖、凋亡以及卵泡闭锁等功能关系密切；而GATA6在卵巢颗粒细胞中功能尚不清楚。目前有关探讨GATA4和GATA6在鹅卵巢颗粒细胞中的功能研究报道较少，本实验以天府肉鹅母系为试验材料，构建GATA4真核表达载体，从而为进一步研究GATA4对下游靶基因、类固醇激素合成、颗粒细胞增殖凋亡等奠定实验基础。

1　材料与方法

1.1材料

异丙醇、氯仿、无水乙醇和氯化钠等试剂均为国产；DNA Marker 2000、 Master Mix等均从北京天根公司购买；胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、琼脂粉、PMD19-T 载体试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；提取总RNA所用TRIzol Reagent为Invitrogen 公司产品；Plasmid mini Preparation Kit（200）质粒提取试剂盒购于碧云天生物技术研究所。引物的合成和序列测定由上海生工完成。

1.1.2质粒与菌株质粒pEGFP-N1由四川农业大学动物遗传育种研究所提供，DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）。

1.2方法

1.2.1鹅原代颗粒细胞培养

取高产期四川白鹅卵巢，分离卵泡的颗粒层，接种于含有10 %胎牛血清、青霉素100 U/mL及链霉素100 U/mL的DMEM培养液中，于37 ℃、5 %CO2、饱和温湿度下培养，每两天换液1次。

1.2.2细胞总RNA的提取

培养的鹅颗粒细胞，1 000 rpm离心6 min，收集细胞。以TRIzol试剂盒抽提细胞总RNA，紫外分光光度法测定A260/A280，使用的标本符合A260/A280介于1.8～2.0

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1.2.3鹅GATA-4基因扩增片段的引物设计及合成

根据GATA4基因序列（登陆号：KC454275）设计引物T1、T2扩增全长GATA4，上下游引物分别在5’端引入EcoRI及BanHI酶切位点，上游引物T1为：5’-CCGGAATTCATGTACCAGAGCTTAGCCA-3’；下游引物T2为：5’-CGCGGATCCTTATGCCGTTATGA TGTCCC-3’。产物长度1 236 bp。

1.2.4RT-PCR体外扩增目的基因片段

参照上述提取RNA步骤提取鹅颗粒细胞总RNA，逆转录生成cDNA。PCR扩增目的基因，扩增的反应体系，反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变形30 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，40个反应循环，72 ℃最后延伸5 min。

1.2.5目的基因片段PCR产物的纯化、克隆

PCR产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，胶回收PCR产物，克隆连接至PMD19-T，将克隆有目的基因GATA4的重组质粒PMD19-T/GATA4进行酶切验证，并进行序列测定，以检测其核苷酸序列与GATA4基因序列的编码区是否完全一致。EcoRⅠ和BamH I酶切位点已事先添加在目的基因GATA4上下游。

1.2.6重组载体pEGFP-N1/TNFR 1的构建、筛选与鉴定

将上述酶切产物与载体pEGFP-N1连接，连接产物室温下过夜，然后将新质粒导入感受态DH5α，菌液涂于含卡那霉素琼脂糖平板上，37 ℃过夜培养，挑取抗性单菌落，进行质粒DNA扩增，应用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA，用EcoR I和

BamH I限制性内切酶进行酶切，1.5 %琼脂糖凝胶电泳筛选，最终筛选出质粒并再次进行目的基因的测序验证。

2　结果

2.1卵巢RNA提取结果

本试验采用Trizol法进行鹅颗粒细胞总RNA提取，经1.5 %琼脂糖凝胶电泳结果显示（图1），18S和28S条带清晰，5S条带较弱，表示得到的RNA无降解，无DNA污染，可以进行下一步试验。

2.2质粒的鉴定

所有产物在1.5 %琼脂糖上进行检测（图2），GATA4 cDNA全1 236 bp（1.2 kb），之后连接到pMD19-T载体上，通过EcoR I和BamH I进行双酶切，电泳图如图2B所示，产生2条带，一条1.2 kb左右的目的带，一条2.7 kb左右的载体带。酶切后进一步的连接到pEGFP-N1载体上，双酶切后电泳检测，图2C所示，一条目的带（1.2 kb）和一条载体带（4.7 kb）。挑选阳性克隆并测序，与之前获得并提交的GATA-4序列完全一致。

2.4重组质粒pEGFP-N1/GATA4插入GATA4基

因核苷酸序列的测定。

测序结果显示重组质粒pEGFP-N1/GATA4中插入基因长1 236 bp，为一开放阅读框架，与Genebank中公布的鹅GATA4 mRNA基因完全相符，且方向正确。

3　讨论

在前期实验中，我们已经报道了GATA4基因完整编码区序列、分子结构，以及在鹅卵泡发育过程中的表达模式［1］。研究已证实GATA4在类固醇生成、性别分化和细胞凋亡方面具有重要的作用［2］，其在卵巢方面的功能作用就是调节GATA依赖性的靶基因的翻译后修饰［3］，GATA4磷酸化水平是由cAMP通过PKA途径进行调节的［4］，磷酸化增加了GATA4的DNA结合能力并且反式激活下游多个靶基因的启动子，包括STAR［5］、CYP19A1［6］、CYP11A1［7］、BCL2［8］、INHA［9］、GnRHR［10］等与卵泡发育有重要作用的基因。

此外，GATA4表达的上调伴随着人和小鼠初级卵泡颗粒细胞的快速增殖［11］，下调GATA4表达则与鼠的颗粒细胞凋亡有关，并且伴随着成年小鼠卵巢的闭锁［12］。促性腺激素（PMSG、FSH）也对GATA4的表达具有上调作用［12］。这些都表明GATA4是多种类固醇激素合成基因的转录调控者，通过激活器目标基因的转录，介导和调节类固醇激素正常分泌与表达过程，间接参与颗粒细胞分化及凋亡调节，从而调节卵泡的发育。

本试验欲为了深入研究GATA4调节鹅卵巢颗粒细胞中重要的GATA依赖性的靶基因的翻译后修饰的功能，首次成功构建了GATA4真核表达载体pEGFP-N1/GATA4，为后续研究GATA4基因怎样通过翻译后修饰调控靶基因的功能以及对颗粒细胞增值凋亡，卵泡发育的影响等奠定实验基础。

S835

A

1001-0769（2016）10-0058-03

袁袁鑫（1990- ），男，汉族，硕士研究生。助教，从事禽类育种与研究工作。

**通信作者：王继文（1964- ），男，博士研究生，教授，从事禽类育种与研究工作。